酶组织化学各论技巧.pptVIP

（2）孵育液的配制：3％β-甘油磷酸钠 10ml（底物）2％巴比妥钠 10ml（缓冲液）2％氯化钙 20ml（捕获剂）5％硫酸镁 5ml（激活剂）D.W 5ml孵育液最终pH值9.4，置于冰箱保存。 （3）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片（可用10％福尔马林 固定10min，或不固定）②入孵育液，37℃孵育 30～60min （磷酸钙沉淀形成）③蒸馏水冲洗 5min④置2％硝酸钴内 2min（磷酸钴形成）⑤蒸馏水冲洗⑥置1％硫化铵溶液内 1min（硫化钴形成）⑦蒸馏水冲洗⑧甘油明胶封固 （非脂溶剂稳定沉淀） （4）结果与评价：碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。该法的反应产物可发生扩散，故定位欠准确。 （5）对照：从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法。 2.偶氮-偶联法光镜显示方法 （1）偶氮色素法的原理 偶氮色素法是捕捉与磷酸同时释放出的醇或酚，以偶氮色素的形式产生沉淀的方法。如底物使用β－磷酸萘酯，通过酶的作用，水解生成的β－萘酚，后者为重氮盐捕捉，生成红色的偶氮色素沉淀。 （2）孵育液的配制：萘酚AS（或萘酚AS-MX）10～25mg（底物）N，N-二甲基甲酰胺液 0.5ml（促溶剂）0.2mol/L Tris－盐酸（pH9.2） 50ml（缓冲液）坚牢蓝B 50mg（捕获剂） 以上混合和过滤，必要时可用氢氧化钠调整pH9.0～9.2值。 （3）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片；②入孵育液，37℃或室温 5～60min  （有色沉淀形成）③双蒸馏水冲洗 3～5min④4％甲醛，室温下固定 10～50min⑤蒸馏水冲洗 3～5min⑥甘油明胶封固。 （脂溶性沉淀） （4）结果与评价：采用不同的重氮盐，酶的活性显色也不同 萘酚法有三个优点：①反应产物溶解度小，局部比较明显；②萘酚化合物能比较快地被水解，可缩短孵育的时间；③反应产物立即可见，并显示出颜色。 （2）孵育液的配制：0.2mol／L Tris-HCl（pH8.5） 1.4ml（缓冲液）3％β-甘油磷酸钠 2.0ml（底物）0.015mol／L MgSO4液 2.6ml（激活剂）蔗糖 0.5g （和缓剂）0.5％柠檬酸铅 4.0ml（捕获剂） 共计 10ml（pH9.0～9.4） （4）结果与评价：磷酸铅呈现高电子密度颗粒，主要分布在细胞膜上。 （5）对照：孵育液中去除底物或加入抑制剂（如β苯丙氨酸或四唑或溴四唑），则酶活性为阴性。 （4）结果与评价：阳性沉集物为高电子密度颗粒。 （5）对照：去底物对照，抑制剂对照，硝基酚磷酸钠。 5.酸性磷酸酶的生物学意义 酸性磷酸酶广泛分布于生物体内，一般认为酸性磷酸酶位于溶酶体，是溶酶体的标志酶。 ATP酶种类繁多，重要的ATP酶有： （1）细胞膜ATP酶 Na+、K+-ATP酶和Ca2+、Mg2+-ATP酶。 （2）肌球蛋白ATP酶 因它可被Ca2+激活，故又称为Ca2+-ATP酶。 （3）线粒体ATP酶 Mg2+-ATP酶可被Mg2+所激活。 （4）溶酶体膜ATP酶 H+、K+-ATP酶。 （4）结果与评价：酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。电镜下阳性沉集物为高电子密度颗粒。 3）结果与评价：酶活性部位呈黑色，胞核呈暗褐色。 1.光镜显示LDH的四唑盐法 （1）原理 氢从反应生成的NADH，通过受氢体 PMS供给四唑盐，被还原的四唑盐形成不溶性甲 ，可进行观察。 （2）孵育液的配制0.2％NBT 1ml（捕获剂，受氢体）0.7％NAD+ 1ml（递电子体）0.27％PMS 1ml（递电子体）19.2％乳酸锂 1ml（底物）0.1mol Tris盐酸 1ml（缓冲液）蒸馏水 4m