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综合性试验（二） 用改良J—G法测定血清总胆红素及直接胆红素 目的和要求 掌握： 1.改良J—G法的基本原理，了解此法测定胆红素的影响因素及其优缺点。 2.了解目前临床使用的其他测定胆红素的方法。 原理 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮双吡咯胆红素；非结合胆红素须用加速剂咖啡因一苯甲酸钠破坏其分子内氢键后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮双吡咯胆红素。重氮反应时pH6．5，反应后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色。 试剂 1．咖啡因试剂 2．对氨基苯磺酸溶液 3．亚硝酸钠溶液 4．重氮试剂：将试剂2与3按4:0.1混合 5．抑制剂 6. 碱性酒石酸钠溶液 7．胆红素标准液 操作步骤 加入物(ml) 总胆红素 空白管 血清 0.2 0.2 咖啡因试剂 1.6 1.6 对氨基苯磺酸溶液 0 0.4 重氮试剂 0.4 0 每加一种试剂后混匀， 总胆红素管置室温l0min 抑制剂 0.05 0.05 碱性酒石酸钠溶液 1.2 1.2 总胆红素 结合胆红素 加入物(ml) 结合胆红素 空白管 血清 0.2 0.2 咖啡因试剂 0 1.6 双蒸水 1.6 0 对氨基苯磺酸 0 0.4 重氮试剂 0.4 0 室温反应1min，准确计时 抑制剂 0.05 0.05 酒石酸钠溶液 1.2 1.2 混匀，600nm，1cm光径比色，空白管调零，读取各管吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度 标准曲线的制作 ml 1 2 3 4 标准1 空白1 标准2 空白2 标准3 空白3 标准4 空白4 12mg/dl标准液 0.05 0.05 0.1 0.1 0.15 0.15 0.2 0.2 生理盐水 0.15 0.15 0.1 0.1 0.05 0.05 0 0 咖啡因试剂 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 对氨基苯磺酸 0 0.4 0 0.4 0 0.4 0 0.4 重氮试剂 0.4 0 0.4 0 0.4 0 0.4 0 混匀，RT10min 碱性酒石酸钠溶液 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 混匀，600nm,1cm光径，对应空白管调零，测各标准管吸光度， 以浓度为X轴，吸光度为Y轴，作标准曲线 相当于胆红素浓度 3 6 9 12 结果计算 用测定管吸光度与空白管吸光度之差值在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。 参考范围 血清总胆红素： 5.1—19μmol/L 血清结合胆红素：1.7—6.8μmol/L 注意事项 1．胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。 2．叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。 3．血脂及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定。 4．本法测定血清总胆红素，在10—37℃条件下不受温度变化的影响。呈色在2h内非常稳定。 注意事项 5．标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。 6．胆红素大于342μmol/L的标本可减少标本用量，或用0.154mmol/L NaCL溶液稀释血清后重测。 7．结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应少、结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。 方法学评价 血清胆红素测定广泛使用的是重氮试剂法，由于反应条件不同而衍生出多种方法，我国推荐其中的改良J—G法，其特点是：使用咖啡因一苯甲酸钠作为加速剂促进重氮反应快速完成；加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素转变成蓝色偶氮胆红素，减少Hb等有色物质的干扰，提高检测的灵敏度。但本法需3次加试剂，一般无法在全自动生化分析仪中使用。在应用上受到很多限制。 方法学评价 目前发展了一些新的方法使胆红素测定能够自动化。如： （1）胆红素氧化酶法（BOD法），其基本原理利用BOD将胆红素(黄色)氧化，其在450nm附近的吸收下降，其下降程度与胆红素的量相关。在pH8.0左右时结合胆红素及未结合胆红素均被氧化从而可测定出总胆红素量；在pH3.7—4.5时结合胆红素可被氧化而未结合胆红素不被氧化从而可测出结合胆红素量。胆红素氧化酶法特异而准确，但酶制剂来源困难，价格高，使用尚很少。 （2）钒