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动物克隆技术1.概述（动物克隆的发展史）2.动物克隆的原理，方法，步骤3.动物克隆的应用4.动物克隆的前沿发展1.定义 “克隆”( clone) ,是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。 在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。 根据核卵供体的来源不同可分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物两种。1996年 第一只成年体细胞克隆羊“多利” 诞生1997年 一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。1998年 两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。 一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠2000年 曾参与克隆“多利” 羊的英国公司培育了第一 批克隆猪 2001年 一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。2002年 法国研究人员克隆出兔子。2003年 美国科学家推出了一匹克隆骡。 爱荷华州的研究人员称他们克隆出了一头濒临灭绝的爪哇 野牛。2004年 美国加利福尼亚的一家公司培育出了第一只克隆猫。这只猫后来成为第一只被卖出的克隆宠物。2005年 韩国科学家宣布他们培育出了首条克隆狗叫“斯纳皮”世界10年克隆研究之路 首条克隆狗- “斯纳皮”2.动物克隆的原理，方法，步骤克隆的理论基础 克隆技术得以实现的理论基础在于“细胞的全能性”。 细胞的全能性是指细胞包含个体的全套遗传信息，在特定环境因素的调节下，可回到受精卵一样的状态，从头开始发育成一个完整的生物个体，只有具备全能性的动物组织细胞，才可用于克隆动物。动物克隆的基本过程1.核供体动物的选择与细胞核的获得。 2.核受体动物的选择与细胞核的移出。3.供体核的移入及原核的取出。 4.胚泡的体外试管培养。5.代母的选择与胚泡移入子宫。6.克隆动物的体内发育与出生。要点： 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。 MⅡ期的卵母细胞已经成熟，维持的时间长，并且有较高MPF(促成熟因子maturation promoting factor)活性有利于供体细胞核的重编程。核供体细胞的准备： 在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。 细胞核移植： 常用的核移植方法显微注射有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射：用一个外径5～8μm 的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内。透明带下注射：把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。 细胞融合法。用仙台病毒或PEG介导融合，这种方法效果很不稳定而 细胞融合法。用仙台病毒或PEG介导融合，这种方法效果很不稳定而激活： 卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。 精子进入带来的Ca2+浓度的上升和随后卵母细胞内Ca2+的周期性波动。二是由与Ca2+浓度上升介导的信号传递，导致MPF的降低。重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。 羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。 猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。 大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。胚胎移植： 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔克隆又分为胚 胎 克 隆与体细胞克隆1.胚 胎 克 隆： 使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段 的胚胎，叫做胚胎克隆。2.体细胞克隆： 使用的核供体细胞来自动物的体细胞，叫做体细胞克隆。克隆步骤 1.卵母细胞的去核