黄曲霉测定分解.ppt

黄曲霉毒素的测定 黄曲霉毒素（Aflatoxins,简写AFT），是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素，根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类，其中B大类在氧化铝薄层板上于紫外光下呈现蓝色荧光，而G大类则呈绿色荧光。 黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，其在食品中允许量各国都有严格规定。AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严重。 黄曲霉毒素允许量标准 食品品种允许量标准（ppb或10-6） 玉米、花生、花生油　≤20 玉米及花生制品　　　≤20 大米、其他食用油　　≤10 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 婴儿代乳食品　　　　不得检出 一、原理 试样提取液经过滤、稀释后，通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。黄曲霉毒素样品通过固定相时，与固定相上抗体分子有特异亲和力的黄曲霉毒素即被固定相上抗体结合，其它与抗体没有亲和力的无关组份随流动相流出；利用有机溶剂甲醇使固定相上抗体变性，将与固定相上抗体结合的目标分离物（黄曲霉毒素B1）洗脱下来，再利用黄曲霉毒素的荧光特性，通过NYART—1型黄曲霉毒素速测仪进行快速定量检测。 二、试剂、材料 1、仪器校准溶液； 1.1、零点校准液 1.2、500校准液 2、色谱纯甲醇 3、黄曲霉毒素B1荧光增强剂 4、黄曲霉毒素B1免疫亲和微柱 5、二次蒸馏水或超纯水 6、色谱纯石油醚或重蒸石油醚 7 提取液即70%甲醇水溶液（含4%氯化钠）：40 g氯化钠用适量水溶解，加入700 mL色谱纯甲醇，用水定容至1000 mL 8色谱纯石油醚或重蒸石油醚 9 提取液即70%甲醇水溶液（含4%氯化钠）：40 g氯化钠用适量水溶解，加入700 mL色谱纯甲醇，用水定容至1000 mL； 三、仪器设备 1、NYART-1 型黄曲霉毒素B1快速测定仪 2、负压抽滤装置 3、旋涡混合器 4、微孔过滤膜（聚偏氟乙烯，F型，孔径0.45μm） 5、试管架（8孔） 6、慢速定量滤纸 7、50mL具塞玻璃试管：直径12 mm ，长 75mm，无荧光特性 8、10mL具塞玻璃试管 9、10 mL移液管 10、1000μL微量取样器 11、200μL微量取样器 四、操作步骤 1、植物油、酱油、食醋等样品提取液制备 准确称取试样5.0g于50mL具塞玻璃试管中，准确加入10mL石油醚，盖上塞子后在旋涡混合器上混合30s，再准确加15.0mL 70%甲醇水溶液（含4%氯钠），在旋涡混合器上震荡混合5分钟， 震荡混匀后静置分层2-3分钟，用移液器把上层的石油醚-油取出去掉，从大试管的底部准确取下层溶液3 mL，并加入8.0mL纯水稀释，混匀，用0.45μm 有机相滤膜过滤，取滤液9mL准备过亲和微柱。 2、样品提取液纯化 将黄曲霉毒素B1免疫亲和微柱与负压抽滤装置连接，把5mL移液器吸液头连接到免疫亲和微柱上，加入3mL超纯水，打开真空泵调压阀后，打开电源，调节压力进行抽滤，洗脱免疫亲和微柱内的缓冲溶液，液面控制在免疫亲和微柱内的上塞板处*，然后加入上述已经制备好的滤液进行抽滤， 使样品提取液以1.5mL/min流速通过微柱，用移液器取7.0mL（3：2：2）超纯水分三次淋洗过柱*，至亲和微柱的微球层上部剩余一点溶液，停止抽滤，弃去全部流出液。尽量从底部准确加入1 mL色谱纯甲醇洗脱（流速约为1 mL/min*）收集全部洗脱液于玻璃试管或比色皿中（此步可以全部抽空），准确加入1 mL超纯水混匀，盖上比色皿盖，准备在速测仪上进行测定。 备注： *A: 如果溶液全部抽滤下来，会使亲和微柱中微球层产生断裂而积存空气，再用100%甲醇淋洗时会使微球上结合的黄曲霉毒素洗脱不完全，结果的准确度降低，所以亲和柱中要留少许溶液。 *B：7.0mL纯水（3：2：2）淋洗过柱时，水从上面分三次旋转加入，分别是3、2、2 mL，使杂质清洗得更完全。 *C：缓慢抽滤是为了使甲醇完全和微球接触，使黄曲霉毒素完全和抗原分离而被洗脱下来。 3、黄曲霉毒素B1含量的测定 1、在速测仪上选择进入仪器校准界面，分别用零点和500校准液对仪器进行校准。 2、选择进入相应的样品检测功能界面， 将有8.4待检测液的比色皿放进样品室中,拉上舱门，测定本底。 3、在比色皿中加入黄曲霉毒素B1荧光增强剂0.2 mL混合均匀，反应约2分钟,测定含量,保存或者打印结果（单位：μg/kg）。 4、测定结果 测定结果以两次平行测定结果的算术平均值表示。 项目八 黄曲霉毒素测定 其他 凡接触