课程名称微生物学及微生物学检验实验.doc

课程名称：微生物学检验技术 授课专业：医学检验 学时：4学时 实验十 链球菌.肺炎链球菌的检验 (Streptococcus and S.pneumoniae Test ) 一、实验目的 1.掌握Streptococcus and S.pneumoniae的分离培养与鉴定方法； 2.掌握甲链，乙链，肺链的染色特性，镜下形态，菌落特征，生化反应结果。 二、实验器材与试剂 1.菌种： 甲链，乙链，肺链 2.Culture media：血平板，血清肉汤，菊糖发酵管，葡萄糖发酵管， 3.试剂：新鲜羊血（兔血），无菌血清，20%葡萄糖水溶液 4.10%去氧胆酸钠溶液；3%过氧化氢，革兰染液，擦镜纸，电吹风 三、实验内容 ㈠ 标本采集： ⒈化脓性炎症：可采集胆汁、炎症渗出物，咽喉拭子等 ⒉亚急性心内膜炎败血症：可抽取血液，尿液等 ⒊风湿热，急性肾小球肾炎：可取血清作抗链“O”试验 ⒋疑是肺炎双球菌感染者：取痰、脓汁，脑脊液，血液 ㈡ 检验程序 标本1、2、3（穿刺液）（已增菌） 　　　接种 BA　分离培养 ３７摄氏度　２４h ＧＳ　触酶　　 接种血清肉汤　菊糖发酵管 ３７摄氏度　２４h 胆汁溶解 杆菌肽　optochin 报告结果 ㈢　培养基的配制 1.血清肉汤 ⑴成分 肉膏汤:100ml 无菌血清:5ml ⑵制法 以无菌手续取血清5ml,加入无菌肉汤100ml ,分装于小试管中,0.9ml/管 ⑶用途： 胆汁溶解试验 ⒉菊糖发酵管 ⑴成分 半固体培养基 100mL 鉴别用糖 1g (20%菊糖水溶液5ml） 1%酸性复红指示剂（酸红碱黄） 0.5ml ⑵原理 细菌能够分解菊糖使培养基变酸，在酸性复红指示剂的作用下，使培养基变红,产气可见气泡 ⑶用途： 鉴别甲链,乙链. ㈣ 药敏试验 ⒈Optochin(乙基氢化羟基喹啉，ethythydrocupreine) 将被检菌K-B划线接种到BA上（或取肉汤培养液，）稍干，贴放5ug/片Optochin纸片，35摄氏度　18h，划线要密 ⒉杆菌肽 取待检菌的纯培养物均匀涂布于BA上，稍干后贴上含0.04g的杆菌肽纸片，35摄氏度，18-24h培养 四、实验结果 ㈠培养物观察 BA 甲链 乙链 肺链 圆形 凸起 S型 灰白色 似针尖的半透明菌落 α-溶血 圆形 凸起 S型 灰白色 似针尖的半透明菌落 β-溶血 圆形 灰白色 半透明 细小 有光泽的扁平菌落 α-溶血 血清肉汤 生长管底 呈颗粒状沉淀 上清液清亮 絮状沉淀 混浊生长（留少许沉淀）之后自溶清亮 菊糖发酵 胆汁溶解 杆菌肽 optochin 触酶 — — — — — — — + — — + + — + — ㈡生化反应；药敏试验 1.胆汁溶菌试验 ⑴原理： 某些细菌具有自体溶解酶，如肺链，胆汁或胆盐能促进自体溶解酶产生自溶现象，借此鉴别不同的细菌。 ⑵方法 ①试管法：取小试管2支，各加被检菌，（液体培养物0.9或0.8）18-24h，35℃后，1支加10%去氧胆酸钠溶液0.1ml，另一支做对照，2支同时 37℃水浴10-15 min ,观察结果。对照管仍混浊，加胆盐管变透明为阳性。 ②平板法 取10%去氧胆酸钠溶液-接种环，滴于BA被检细菌菌落上，37℃培养30分钟，观察结果，若菌落消失为阳性。 ⑶注意事项 ①去氧胆酸钠溶液，在酸性环境中易发生沉淀。若被检细菌的液体培养物为酸性时，应先矫正 PH为弱碱性后，再进行试验。 ②牛胆汁的溶菌作用比去氧胆酸盐差，时间应长些，且不适用于平板法。 ③胆盐（或胆汁）只能促使活菌产生自溶，对死菌无作用。 2.杆菌肽试验 ⑴原理： A群溶血性链球菌对杆菌几乎100%敏感，而其它链球菌对杆菌肽通常耐药。故此试验可对链球菌进行鉴别。 ⑵结果判断，解释和报告： 在杆菌肽纸片周围出现明显抑菌环（ 10mm）为杆菌肽敏感试验为（+），抑菌环（ 10mm）为耐药。此试验是鉴别A群链球菌和其它链球菌的一个重要试验。 3.Optochin敏感试验 ⑴原理： Optochin（乙基氢化羟基喹啉，ethythydrocupreine）能干扰肺炎链球菌叶酸合成，抑制该菌生长，故肺链对Optochin敏感，其它链球菌对其耐药。 ⑵结果判断，解释和报告：抑菌圈直径14mm为敏感，14 mm为耐药。此试验是鉴别肺炎链球菌和甲型链球菌。 4.革兰染色 甲链：G+，球形，呈链状排 乙链：G+，球形，呈链状排列 肺链：G+，球形，矛头状，呈双排列 五、实验安排 第一天： (一)制备培养基，贴上标签，上交讲台，统一分发 ⒈ 第一台：制备血液培养基 400m