【2017年整理】人参皂甙Rh2和桦木酸协同诱导A549细胞凋亡的研究.docVIP

人参皂甙Ｒｈ２和桦木酸协同诱导Ａ５４９细胞凋亡的研究李　清１，２，　王晓宇１，　金英花１（１．吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，吉林长春　１３００１２；２．大连大学生物工程学院，辽宁大连　１１６６２２）摘　要：我们已经发现，天然成分人参皂甙Ｒｈ２（Ｇ－Ｒｈ２）和桦木酸（Ｂｅｔ　Ａ）能够协同作用诱导人源肺癌Ａ５４９细胞死亡．通过细胞形态观察、流式细胞检测分析、酶活性测定、免疫印记分析等实验技术，从细胞和分子水平提供证据，证明了Ｇ－Ｒｈ２和Ｂｅｔ　Ａ协同诱导Ａ５４９细胞死亡的过程为细胞凋亡作用，且涉及线粒体途径．关键词：细胞凋亡；桦木酸；人参皂甙Ｒｈ２；协同作用中图分类号：Ｑ２９１　　　文献标识码：Ａ细胞凋亡通路受阻是导致癌细胞抗药性的主要原因［１］，因此，诱导细胞凋亡是大多数抗肿瘤治疗的主要机制．细胞凋亡通路可能通过不同的途径被启动，如死亡受体途径或线粒体途径，２种途径最终引起效应Ｃａｓｐａｓｅ（含半胱氨酸的、天冬氨酸特异的蛋白酶家族）的激活．大部分药物诱导的细胞凋亡通过线粒体途径［２］．近年来，联合治疗成为抗肿瘤研究的一个重要手段，因为２种药物协同作用有助于放大较弱的死亡信号．所以，联合治疗可能成为一个克服单一治疗阻碍的强有力的策略［３］．在以往工作中，我们已通过ＭＴＴ实验证实了天然成分人参皂甙Ｒｈ２（Ｇ－Ｒｈ２）和桦木酸（Ｂｅｔ　Ａ）能够协同作用诱导人源肺癌Ａ５４９细胞死亡．本次研究中，我们将通过观察细胞形态学变化，流式细胞仪分析凋亡细胞（ｓｕｂ－Ｇ１期细胞）百分比，分析细胞凋亡关键因子Ｃａｓｐａｓｅ－３激活情况及其底物ＰＡＲＰ（多聚（ＡＤＰ－核糖）聚合酶）断裂情况以及Ｃａｓｐａｓｅ－９的激活情况等，从细胞和分子水平提供证据，探讨该过程的分子机制．１　材料与方法１．１　试剂与材料人源肺癌Ａ５４９细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；Ｇ－Ｒｈ２购于Ｔｈｅ　Ｋｏｒｅａｎ　Ｇｉｎｓｅｎｇ　ａｎｄ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｂｅｔ　Ａ和辣根酶标记羊抗兔抗体购于Ｓｉｇｍａ公司；细胞培养基（ＤＭＥＭ）和小牛血清购于ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司；Ｃａｓｐａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ购于Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ 公司；ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ购于Ｐｉｅｒｃｅ公司；ＥＣＬ－ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔｓ购于Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；ＰＡＲＰ兔抗抗体购自Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ公司；兔抗Ｃａｓｐａｓｅ－９抗体购自Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司．１．２　细胞培养用含１０％（Ｖ／Ｖ）热灭活小牛血清、１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００μｇ／ｍＬ链霉素的ＤＭＥＭ 培养基培养Ａ５４９细胞，并置于３７℃、５％ＣＯ２、潮湿的培养箱中孵育．１．３　染色体凝聚与核断裂分析指数生长的Ａ５４９细胞计数，按５×１０４细胞／孔铺２４孔板；培养２４ｈ后，分别加入Ｇ－Ｒｈ２　７．５μｇ／ｍＬ和／或Ｂｅｔ　Ａ　１０μｇ／ｍＬ作用２４ｈ；轻轻吸去培养液，每孔加入１ｍＬ预冷的７５％乙醇固定细胞５ｍｉｎ；柔和吸净上清，每孔加入３００μＬ含０．１ｍｇ／ｍＬ二脒基苯基吲哚的甲醇溶液使细胞核和ＤＮＡ可见，用荧光显微镜对同一细胞区域分别拍摄可见光和荧光照片．１．４　流式细胞检测分析取指数生长的Ａ５４９细胞计数，按１．６×１０６细胞／个铺１００ｍｍ培养皿；培养２４ｈ后，分别加入ＧＲｈ２　７．５μｇ／ｍＬ和／或Ｂｅｔ　Ａ　１０μｇ／ｍＬ作用２４ｈ；４℃条件下，分别将上清及胰酶消化后的贴壁细胞收入同一离心筒；４℃、３　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，向沉淀中加入１ｍＬ预冷的ＰＢＳ，混匀沉淀并将其移入ＥＰ管；４℃、３　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，向沉淀中加入１ｍＬ预冷的７５％乙醇固定细胞，置于４℃保存；用ＰＢＳ洗２次后，用碘化丙锭溶液（５０μｇ／ｍＬ）、１μｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅ　Ａ及含３．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的柠檬酸钠为细胞染色，置于暗处冰浴３０ｍｉｎ；用Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ细胞计数仪分析上述细胞，通过测定ｓｕｂ－Ｇ１ＤＮＡ含量定量凋亡细胞．１．５　Ｃａｓｐａｓｅ活性测定蛋白定量后，向９６孔黑板中加入５０μｇ全细胞裂解液蛋白质，再加入２００μＬ含２５μＭｃａｓｐａｓｅ－３底物（Ａｃ－ＤＥＶＤ－ＡＦＣ）的反应缓冲液，于３７℃孵育１ｈ；以１００μＬ含底物的缓冲液加入１００μＬ水作为对照．用ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｏｒ（ＴＥＣＡＮ　ＧＥＮｉｏｓ）仪分别于激发光和发射光波长４０５和５０５ｎｍ处测定底物断裂产生的荧光水平．１．６　全细胞裂解液的制备取指数生长的Ａ５４９细胞计数，按１．６×１０６细胞／个铺１００π培养皿；培养２