【2017年整理】SOD、MDA、GSH.docVIP

改良的盐酸羟胺法测生物样品SOD活性 SOD（T-SOD）活力测定： 原理：羟胺在有氧环境下发生自氧化可产生超氧阴离子，产生的超氧阴离子可由NBT还原率而检测，在SOD存在下，超氧阴离子被分解，NBT还原被抑制。因此，用比色法测定NBT还原产物可以间接反映SOD的酶活力。 仪器：可见光分光光度计 试剂：75mM Na2CO3 /NaHCO3缓冲液（pH=10.2，含0.15mM EDTA-Na2） 5mM NH2OH·HCl 0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml 0.98mM NBT 0.1ml 甲酸 步骤： 用1:5组织匀浆（血清可直接取样），3000rpm离心30min，取上清20ul稀释至0.1ml 按顺序加入如下试剂： 75mM Na2CO3 /NaHCO3缓冲液 2.0ml 5mM NH2OH·HCl 0.5ml 0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml 0.98mM NBT 0.1ml 立即计时，于37℃ 2.0ml甲酸终止反应。 E560nM比色，记录OD值。 计算结果： 酶单位表示：在本实验条件下，抑制率达50%所对应的提取液SOD含量即一个SOD单位（U）。可用每g蛋白（U/g protein）表示。 Mn-SOD活性测定： 基于氰化物抑制CuZn-SOD非Mn-SOD活性的原理，在上述缓冲液中加入KCN，使最终反应体系中的KCN浓度达到2mM，即将缓冲液配成含3mM的KCN。37℃ CuZn-SOD酶活力 = T-SOD酶活力单位 — Mn-SOD酶活力 注意事项： 对照组（非酶管）取样品同体积的三蒸水，其余步骤同样品。 若测血中SOD，可取血清20ul，其余地操作步骤同上。 来自：第四军医大学硕士王建宏学位论文《诊断剂量超声对鼠胚胎和人绒毛脂质过氧化及超微结构的影响》。导师：钱蕴秋。单位及专业：西京医院超声诊断科，超声诊断学。1991.5-1992.6。 参考秦绪军、常耀明硕士论文 原始参考文献： Kono Y. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys. 1978 Feb; 186(1):189-95. 或者Yasuhisa Kono. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Anchives of Biochemistry and Biophysics. 1978 Feb; 186(1):189-95. Yisun et al. Free Rad Res Comms 1988; 4:299-309. 刘树元制作 2003-5-7 荧光法测定血清脂质过氧化产物（MDA） 原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（简称MDA），可与硫代巴比妥酸（简称TBA）缩合，形成红色产物。此红色物质在波长532nm有极大吸收峰，可用分光光度法进行定量测定。若以515nm为激发光，则在553nm有最强荧光强度，故可用荧光法进行微量测定。灵敏度高，再现性好，试样用量少，是该方法的优点。 仪器：荧光分光光度计 试剂： MDA标准储备液（1mmol/L 四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：准确称取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至100ml，放4℃ MDA标准应用液（1μmol/L）：准确量取标准储备液0.1ml于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，用时再准确稀释（现用现配）。 1/24mol/L H2SO4 10% 磷钨酸溶液 0.67％ 硫代巴比妥酸（TBA）：新鲜配制（溶于水与冰醋酸等体积混合液）。 正丁醇（水饱和） 步骤： 血清样品 50μl 1/24mol/L H2SO4 4.0ml 10%磷钨酸 500μl 混匀放置5min 2000rpm离心10分钟 弃上清 ，空在滤纸上 1/24mol/L H2SO4 2.0ml 10%磷钨酸 300μl 混匀放置5min， 2000rpm离心5分钟 弃上清 ，空在滤纸上 样品管