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基因工程药学习题整理（五位同学的努力成果，仅供参考，不保证答案完全正确和详尽~考试还是要大家花点功夫努力一下哦~各位加油↖(^ω^)↗） 2009-12-26 15:27 | (分类:默认分类) 1、? 上游技术：(1)获得目的基因（2）组建重组质粒（3）构建基因工程菌（4）鉴定目的基因?????? 下游技术：（5）培养工程菌（6）产物分离纯化（7）除菌过滤（8）半成品检定（9）成品检定（10）包装 2、? 限制性核酸内切酶 生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主要存在于原核细菌中。 其类型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅱ型最主要 【Ⅱ型限制性核酸内切酶】 1、能识别双链DNA分子中4—8对碱基的特定序列 2、大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 3、识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 DNA连接酶 1、修复双链DNA上的缺口处的磷酸二酯键 2、修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 3、连接多个平头双链DNA分子 DNA聚合酶 【大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ】 1、5ˊ→3ˊ的DNA聚合酶活性 2、5ˊ→3ˊ的核酸外切酶活性 3、3ˊ→5ˊ的核酸外切酶活性? 用途：缺口平移标记法，制备32P标记的探针 【大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段】 用途：1、补平由核酸内切酶产生的5ˊ粘性末端 2、DNA片段的同位素末端标记 3、cDNA第二链的合成 4、双脱氧末端终止法测定DNA序列 【T4—DNA聚合酶】 1、5ˊ→3ˊ的DNA聚合酶活性和3ˊ→5ˊ的核酸外切酶活性 2、在无dNTP时，可以以任何3ˊ—OH端外切 3、在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 4、在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 用途：1、切平由核酸内切酶产生的3ˊ粘性末端 2、? DNA片段的同位素末端标记 【依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）】 1、? 以RNA为模板聚合cDNA链 2、? 双向外切DNA—RNA杂合链中的RNA链 【TaqDNA聚合酶】 1、5ˊ→3ˊ的DNA聚合酶活性 2、无3ˊ→5ˊ的外切酶活性 核酸酶 【单链核酸外切酶】（核酸外切酶Ⅳ） 大肠杆菌的核酸外切酶Ⅳ不需要镁离子 【双链核酸外切酶】（核酸外切酶Ⅲ） 大肠杆菌的核酸外切酶Ⅲ特异性地从3ˊ端外切 【双链核酸外切酶】（λ核酸外切酶） λ核酸外切酶特异地从5ˊ端外切 【单链核酸内切酶】 1、? 2、? RNA的速度比降解双链DNA快75000倍 3、? 4、? PH范围为4.0—4.3 5、? Nacl? 10—300mM 6、? DNA的速度比降解单链RNA快7倍 【单链内切双链外切的核酸酶】 （笔记没有抄到，同志们自由发挥吧） 核酸修饰酶 【末端脱氧核苷酰转移酶】 来自小牛胸腺，不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 【碱性磷酸单酯酶】 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP） 【T4—多核苷酸磷酸激酶】（T4—PNP） 在DNA、RNA、dNR、NR的5ˊ—OH上加磷用于探针的末端标记 3、常用的基因克隆载体质粒有哪些基本特征 1.在宿主细胞内必须能自主复制 2.必须具备合适的酶切位点，供外源基因插入，同时不影响其复制 3.有一定的选择标记，用于筛选，最好有较高的拷贝数，便于载体的制备 4、请举例说明主要的基因表达系统有几类，比较其产物、产生部位、培养方式、提纯难易、产物活性和潜在危险等方面的异同 答：（1）原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： a 结构基因均有调控序列； b 表达过程都具有复杂性，表现为多环节； c 表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性； （2）与原核生物比较，真核生物基因表达调控具有自己的特点： a 真核生物基因表达调控过程更复杂； b 基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等； c 转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性； d 转录后加工过程； e 正负调控机制； f RNA聚合酶种类多。 5、转化子的筛选和鉴定有哪些方法？ （一）插入失活法 外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。目前常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。 （二）PCR筛选和限制酶酶切法 提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。 （三）核酸分子杂交法 制备目的基因特异的核酸探针，通