專题5课题3血红蛋白的提取和分离.ppt

* 课题3　血红蛋白的提取和分离 一、蛋白质的提取、分离和鉴定的方法 1.凝胶色谱法——血红蛋白的分离方法: (1)概念:根据_____________的大小分离蛋白质的有效方法,也 称做___________。 相对分子质量 分配色谱法 (2)原理: ①凝胶 ②分离原理: _________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程 _____,移动速度较慢,通过凝胶的时间_____;_____________ _____的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动, 路程_____,移动速度较快,通过凝胶的时间_____。 多孔球体 多糖类化合物 贯穿的通道 相对分子质量较小 较长 较长 相对分子质量 较大 较短 较短 2.缓冲溶液: (1)作用:在一定范围内,缓冲溶液能够抵制_____________对溶 液pH的影响,维持pH基本不变。 (2)配制:通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,调节缓冲 剂的_________就可以制得___________________的缓冲液。 外界的酸和碱 使用比例 在不同pH范围内使用 3.电泳——血红蛋白的分离或鉴定方法: (1)概念:带电粒子在_____的作用下发生_____的过程。 (2)原理: ①许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有_________ _____,在一定的pH下,这些基团会带上_____或_____。 ②在电场的作用下,这些带电分子会向着_________________ _______移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子_______________以及分 子本身的_____、_____的不同,使带电分子产生不同的_____ _____,从而实现样品中各种分子的分离。 电场 迁移 可解离的 基团 正电 负电 与其所带电荷相反 的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移 速度 二、蛋白质的提取和分离过程 1.样品处理:血红蛋白由_____肽链组成,包括两条________和 两条________。每条肽链环绕一个___________基团,此基团可 携带_________或_______________。 四条 α-肽链 β-肽链 亚铁血红素 一分子氧 一分子二氧化碳 (1)红细胞的洗涤: ①目的:___________。 ②方法: 去除杂蛋白 黄色血浆 暗红色 红细胞 五倍体积 生理盐水 (2)血红蛋白的释放： 蒸馏水 10 (3)分离血红蛋白溶液: 离心后试管中的溶液分为4层,从上往下依次为: 第1层:无色透明的_______。 第2层:脂溶性物质的_______——白色薄层固体。 第3层:_________的水溶液——_____透明液体。 第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。 将试管中液体用_____过滤,除去_____________,于分液漏斗中 静置片刻后,分出下层的_________液体。 甲苯层 沉淀层 血红蛋白 红色 滤纸 脂溶性沉淀层 红色透明 (4)透析——粗分离: ①过程:取1 mL的_________溶液装入_______中,将其放入盛有 300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的___________中(pH为 7.0),透析12 h。 ②原理:透析袋能使_______自由进出,而将_______保留在袋 内。 ③目的:去除_____________________________。 血红蛋白 透析袋 磷酸缓冲液 小分子 大分子 样品中相对分子质量较小的杂质 2.纯化——凝胶色谱操作: 制作___________ 　 装填___________:因为干的凝胶和用_____________的凝胶的 体积差别很大,所以装柱前需要根据色谱柱 的内体积计算所需要的凝胶量。在装填色谱 柱时,不得有_____存在。 　 _________________ 凝胶色谱柱 凝胶色谱柱 缓冲液平衡好 气泡 样品的加入和洗脱 3.纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:判断_____的蛋白质 是否达到要求,需要进行蛋白质___________。鉴定方法中使用 最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 纯化 纯度的鉴定 【思考辨析】 1.判断正误 (1)凝胶色谱法分离蛋白质只根据分子大小,与其携带的电荷 性质和大小无关。( ) √ (2)不同蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质易通过 凝胶颗粒,先从层析柱洗脱下来。( ) 【分析】相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道, 路程较长,移动速度较慢,通过凝胶的时间较长,后洗脱下来;而 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在 凝胶外部移动,路程较