模式生物酵母菌描述.pptVIP

筛选原理 　野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 工程菌及载体 基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。 α-互补 缺陷株基因无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 　操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 　实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 模式生物--大肠杆菌、酵母菌 张红霞 大肠杆菌简介 大肠杆菌（Escherichia coli），是相对简单的单细胞原核生物，所有DNA、RNA 和蛋白质合成的机器都包含在同一细胞器中，可以相对容易的培养和操作。 酵母菌简介 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。 酿酒酵母（Sacharomy cescerevisiae）是第一种至少在一万年前就能被人工培育的真菌，是最简单的真核生物，是由一个细胞组成的独立的生物个体，能在基本培养基上生长，易于培养和操作，被称为真核生物中的“大肠杆菌”。 早在1996年就完成了酿酒酵母的基因组测序，这是人类第一次获得真核生物基因组的完整核苷酸序列，被称为遗传学研究上的一座里程碑。 大肠杆菌基因组 大肠杆菌通常只有一条染色体，比高等生物的基因组要小得多，并且具有较高的基因密度（大约每1 kb 就有一个基因），没有内含子和很少有重复DNA，易于寻找和分析基因. 通过对酵母全基因组序列测定，其基因组大小约为12 Mb，初步确定了5 885 个编码蛋白质的基因，140 个rRNA 基因、275 个tRNA 基因，第一次揭示了一种真核生物的全部基因的数目和大体上的功能分类. 酵母基因组中有将近31％编码蛋白质或者具有开放阅读框，与哺乳动物编码蛋白质的基因有高度的同源性。 酵母菌基因组 酵母与其它真核生物相比，它们的基因组较小（约12 Mb），基因数目也比较少（约5 885）.与大肠杆菌类似，它们可以在实验室里快速繁殖，在理想条件下，每次细胞分裂大约90 min，可以从单个细胞繁殖成克隆群体. 酵母作为模式实验系统最重要的优点是，酵母细胞不仅简单，而且具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色体包装成染色质、细胞质包含了全部的细胞器（如线粒体）和具有细胞骨架结构（如肌动纤维蛋白）等. 大肠杆菌遗传学研究应用 大肠杆菌的生活周期很短，并且单个细胞可以很容易的获得一个遗传上同源的细胞群体（克隆）. 细菌是单倍体，这意味着即使是隐性突变，也能够表现出突变的表型，同时细菌之间可以方便地进行遗传物质的交换，细菌的这些特征便于对其进行遗传学研究. 大肠杆菌作为生命科学研究的模式系统，其主要优势是具有遗传交换系统. 遗传交换使定位突变、构建含多种突变的菌株、构建用来辨别显性突变和隐性突变及进行顺反式分析的部分双倍体的菌株成为可能. 这种遗传交换系统主要通过两种方式构建的. 第一种方式是大肠杆菌通过性结合交换DNA，大肠杆菌的育性质粒（F 因子，F-factor）具备把自身从一个细胞转移到另一个细胞的能