液相色譜法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇.docVIP

液相色谱法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素。主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生。DON污染粮谷的情况非常普遍。世界各地均有报道，特别在中国、日本、美国、阿根廷和南非。在我国胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发区．DON是居民饮食中主要的污染霉菌毒素之一。DON主要在田间侵染小麦、玉米等谷类作物，当人摄入了被DON污染的食物后。会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。 DON化学名称为3，7，15一三羟基一12，13一环氧单端孢霉一9一烯一8一酮，为无色针状晶体。熔点为151。153℃。其化学性能非常稳定，具有较强的热抵抗力和耐酸性．在pH值10．O条件下。100℃加热60min部分被破坏，120℃加热30 min和170℃加热15 min完全被破坏【”。目前，测定粮谷作物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法很多，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、酶联免疫法(ELISA)等。本文采用了液相色谱法，使用海能LC7000液相色谱仪配紫外检测器和C18亲水性分离柱，不仅获得了准确的测定结果．而且极大地提高了工作效率。 l 材料与方法 1．1仪器 海能LC7000液相色谱仪(配备紫外检测器)，7mILOGY呕吐毒素专用净化柱TC—T200，C18亲水性分离柱，旋转蒸发仪，高速均质机，真空泵，小型粉碎机。 1．2试剂 乙腈(Merck，色谱纯)，甲醇(Merck，色谱纯)，呕吐毒素标准品(FERMENTEK LTD)。 1．3 操作步骤 (1)提取称取粉碎过筛样品25．O g于均质杯中，加入100 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液，于高速均质机上均质4 min，静置。 (2)净化浓缩取2 mL样品提取液上清液到净化小柱顶端，向下推活塞，使溶液全部过柱，收集净化后溶液放入100 mL标准磨口蒸发瓶中．取出注射器，加入8 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液到柱顶端，将溶液彻底过柱，合并净化液，于60℃减压蒸干。用2 mL流动相定容。 1．4测定 色谱条件：C18亲水性分离柱(250×4．6 mill，5斗m)，柱温箱40℃，紫外检测器波长220 nm，流动相：y(水)：y(甲醇)：y(乙腈)=92：4：4，流速1．5 mL／rain，进样量20斗L。标准曲线的绘制：使DON质量浓度分别为0．10、0．25、0．50、1．00、2．00、5．00、10．00ug/mL，将该标准系列分别进样20灿L，以DON的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 1．5验证 (1)空白样品制备取空白样品，依据样品的处理方法进行处理。 (2)回收率及精密度试验取空白样品。加入不同体积DON标准储备液，使其最终进样液理论质量比分别为100、300、1 000 Ixg／kg。每个质量比取5个平行样，根据样品的处理方法进行处理。 2 结果 2．1定性分析 DON标准样品定性分析色谱图见图1。 由图l可以看出DON保留时间为14．095 min。 2．2定量计算 样品中DON含量为 式中：x——样品中DON的含量，ug/kg；C——由标准曲线查得进样液质量浓度，ug/mL；样品质量，g 2．3标准曲线 由图2可见线性关系为Y=20．78521X(R=0．99987)，根据信噪比3倍峰面积，计算出本方法的 最低检出限为50ug/kg。 2．4 方法验证 2．4．1专属性 从图3可见。在DON的出峰时间14．095 min左右没有杂质干扰峰，表明本方法专属性很好。 2．4．2 回收率及精密度实验 取两组不同含量的样品各6个．分别确定方法的精密度。结果见表1。 取同一样品，分别加入不同质量比的标准样品，测定回收率．结果见表2。 从表2可见．该检测方法回收率为90．7％-98．9％，可以满足分析的需要。 3讨论 3．1提取方法对回收率的影响目前，采用较多的提取液是y(乙腈)：y(水)=84：16，但提取方法却各不相同，本方法则采用高速均质4 rain。用4种常见的提取方法对添加同样质量浓度0．50 la,g／mL的样品进行提取，测定其回收率，测定结果见表3。 由表3可以看出，振荡、超声、磁力搅拌提取方法的平均回收率只有70％左右，不能满足分析的需要，而高速均质法可使平均回收率达到95．9％。作者曾进一步改变高速均质的时间来对比回收率，实验结果表明，随着均质时间的延长回收率有小幅上升，当均质时间大于4 min后。回收率无明显提高。故本方法确定的最佳提取方式是高速均质4 min。 3．2液相色谱法与气相色谱法、酶