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第一章 1、两次绿色革命的内容、标志及存在的问题。 第一次绿色革命——使用矮秆品种。 主要的内容：大规模地推广矮秆、半矮秆、抗倒伏、产量高、适应性广的优良小麦及水稻品种，并同时改进灌溉、施肥等相关技术。 存在的问题：一、作物单一化。 二、大规模灌溉和施肥对水质的影响。 三、大量施用化学肥料、农药。 第二次绿色革命——杂种优势的利用 第三次绿色革命——转基因技术的利用 第二章 2、基因工程中理论上的三大发现及技术上的三大发明。 理论上的三大发现：一、DNA是遗传物质被证实。 二、DNA双螺旋模型的提出。 三、–“中心法则”的提出。 技术上的三大发明：一、工具酶的发现和应用。 二、反转录酶的发现和应用。 三、载体的发现和应用。 第三章 3、Ⅱ型限制性内切酶。 特点：①识别位点的特异性。 ②识别序列的对称性。 ③切割位点的规范性。 4、载体的必备条件。 ①分子较小，可携带比较大的DNA片段。 ②能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 ③要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）。 ④有适合的标记，易于选择。 ⑤有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 ⑥从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等。 5、质粒提取的原理、步骤。 提取方法：①碱变性法； ②煮沸法； ③SDS法。 原理：基于细菌染色体DNA与质粒DNA变性与复性特征而达到分离目的。 在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的质粒DNA两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc等高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒复性迅速而准确，而细菌染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成网状结构，通过离心，细菌染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物以及细菌碎片等一起沉淀下来而被除去。 步骤： ①接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素的LB 液体培养基。 ↓（37℃摇培过夜（10~12h）；12000rpm, 3min） ②弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 ↓ ③加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀 ↓ ④配制适量的Ⅱ液 ↓ ⑤加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），冰浴，5-10min，此时应有丝状物出现。 ↓ ⑥加150μl Ⅲ液，轻轻混匀， 冰浴，5min以上 此时应有絮状物出现。 ↓12000rpm, 5min ⑦取上清液，加等体积的酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色，5min ↓12000rpm, 10min ⑧取上清液，加2倍体积的冷乙醇，混匀，-20℃，30min ↓12000rpm, 10min ⑨弃去上清液，用70%乙醇清洗沉淀 ↓干燥 ⑩加20μl TE溶解，4℃保存 6、关于图位克隆的原理及其步骤。 概念：该法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析目的基因与已知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体上的位置。 原理： 功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库(包括BAC、YAC、TAC、PAC等)，构建目的基因区域的物理图谱，再利用此图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因，最终克隆目的基因，并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。 步骤： 初步定位→构建连锁图谱→精细定位 →构建物理图谱→染色体步移→确定候选基因→功能互补验证 7、抑制性消减杂交的原理及其技术流程。 原理：通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试(tester)cDNA片段的5’末端，将测试和驱动(driver)进行两轮杂交。标准化步骤均等了测试中的cDNA单链丰度，消减杂交步