[Bluenative-PAGE实验讲义.docVIP

Blue Native PAGE 一．实验原理： Blue Native PAGE（ BN）是Hermann Scha¨gger1991年创立的一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离蛋白质复合物的电泳技术。能分离10KD-10MKD范围内的蛋白质以及蛋白质复合物。 BN以考马斯亮蓝G-250 代替SDS 使蛋白质复合物带负电荷，根据各个不同复合物分子量不同从而在胶中得到分离。这些复合物在胶中以蓝色条带形式呈现。样品用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside (DM),Triton X-100 和毛地黄皂苷(digitonin) 等溶解, 从而使复合物以近似天然的状态分离。 实验中若想进一步分析复合物各个亚基的成分，通常采用BN结合SDS的方式.实验结果如下图所示。 二 实验需要用到的试剂： 咪唑（Imidazole），6-氨基乙酸（6-Aminohexanoic acid），聚丙烯酰胺（Acrylamide (twice-crystallized) ），甲叉双丙烯酰胺.（Bis-acrylamide (twice-crystallized)），20%（W/V）Triton X-100，20%（W/V）dodecylmaltoside (DM)，20%（W/V）digitonin，甘油，5% （W/V）G-250（Coomassie blue G-250）,巯基乙醇（.Mercaptoethano）,过硫酸铵（AP），TEMED，氯化钠 三 溶液的配置 AB-3 mix:称48 g acrylamide 加入大约50mL的ddH2O中，搅匀后定容至100mL，再加入1.5 g bisacrylamide，混匀，三层滤纸过滤后置于棕色瓶中保存。 5%G-250溶液：0.5g G-250，0.6559g 6-氨基乙酸溶于10毫升水中 电极缓冲液和凝胶缓冲液的配方见表1 样品溶解液的配方见表2 分离胶和浓缩胶的配方见表3 四 实验流程： 灌胶 选择合适的玻璃板，用洗涤剂反复擦洗玻璃板，再用自来水反复冲洗，最后用双蒸水漂洗，自然晾干或者用吹风机吹干。隔条以同样的方法洗干净以后，自然晾干或用滤纸吸干。将玻璃板卡入隔条中，短板对负极置于电泳槽中，用1%的琼脂糖封胶。将电泳槽放在4度冰箱中冷却。按照表上所列的方法配好不同浓度的分离胶，用梯度混合仪灌胶。灌完胶后，用水饱和的正丁醇封住胶面，等待凝胶聚合。 大约30分钟后，凝胶的表面出现两个界面，分离胶已经聚合，去掉表面的正丁醇层和水层，再用双蒸水冲洗胶面，直到没有正丁醇的味道为止。用滤纸小心的吸干胶面。 按照表中的方法配好浓缩胶，灌胶，插入梳子，等待凝胶聚合。 2 样品处理 不同的样品有不同的处理方法。现在以海马突触质膜为例讲解样品处理方法。 从-20度冰箱里取出一管用1.5mLEP管装着的海马突触质膜样品，置于37度水浴锅中使其快速溶解。溶解后加入表二所示的solution buffer A 溶液，加到EP管最大刻度处。18000g冷冻离心20分钟，弃上清，取沉淀。称沉淀的重量。按照detergent/protein=3：1的比例加入20%Triton X-100溶液，使Triton X-100的终浓度为2%，用Tip头小心混匀样品，注意不能有气泡，冰上裂解30分钟。然后18000g冷冻离心20分钟，收集上清，测蛋白含量。 取出120微克的样品，加入3微升 5% G-250溶液和5微升 50%的甘油，混匀后即可上样。所有操作均在冰上进行。 3 电泳 将处理好的样品用微量进样器点在上样孔中以后，倒入1ⅹ负极液和正极液，插好电源，以恒压100V开始电泳，待样品跑过浓缩胶后，电压改为250V，之后可以慢慢增大，到样品最后跑完。只要控制电流在50毫安以内即可。待样品跑到凝胶的1/3处更换负极液，将原来1ⅹ负极液换成1/10ⅹ，这样可以降低胶的背景。负极液的配方见表一。电泳过程如下图所示： 4 固定和染色 当样品跑完整个凝胶后，剥胶，固定和染色。这个过程和普通的SDS胶一样。即用固定液（50%ddH2O，40%甲醇，10%乙酸）固定30分钟后，水洗4次，15分钟一次。然后在考染液中染色过夜。 5脱色，扫描 染色过夜后，倒掉考染液，用双蒸水脱色，到背景十分干净为止，扫描。 如果不要分析复合物各个亚基的组分，就可以直接拿Blue Native胶切胶，酶解后质谱鉴定。若还想进一步分析复合物各个亚基的组成，则还要做二向SDS。 五 二向SDS操作过程 1灌胶 选择合适的玻璃板，洗干净后按照上述方法灌胶。SDS%凝胶储液，分离胶buffer,浓缩胶buffer的配制见实验室自编教材《蛋白质组学核