基因工程试验(综合)解析.doc

实验一 大肠杆菌基因组DNA提取与检测 　 一、目的要求 1．学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA； 2. 学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度 二、基本原理 　　 本实验利用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。 三、实验材料 　　 实验菌株：大肠杆菌TG1 实验试剂：LB液体培养基 TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒 无水乙醇 实验仪器：移液枪，低温离心机，水浴锅，eppedorf管，振荡器 四、操作步骤　　 　 1. 大肠杆菌的培养： 从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4 ml的液体培养基中过夜培养。 2. 取1～4 ml的过夜培养菌液，10,000 rpm离心2分钟，弃上清。 3. 用150 μl的SP Buffer（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex） 等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4. 加入20 μl的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5分钟。 5. 加入30 μl的EDTA Buffer，均匀混合后室温静置5分钟。 6. 加入200 μl的Solution A，剧烈振荡后65℃保温10分钟。 注）① 若Solution A出现沉淀，请于65℃加热溶解， 待恢复至室温后使用。② 65℃保温10分钟后，溶液将由乳浊液变成透明液。如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解，基因组DNA将不能释放。 7. 加入400 μl的Solution B，剧烈振荡15秒。 注） 若Solution B出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。 8. 加入650 μl的Solution C，上下颠倒均匀混合。 9. 12,000 rpm离心1分钟。 10. 先弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）移入预先置于1.5 ml离心管上的Filter Cup中，12,000 rpm离心1分钟。 注）有机相（上层）请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。 11. 弃Filter Cup，在滤液中加入450 μl的DB Buffer，混合均匀。 12. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 13. 将上述操作11的混合液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 14. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 15. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 注）请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。 请沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。 16. 重复操作步骤15。 17. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。 18. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 注）把水或Elution Buffer加热至65使用时有利于提高洗脱效率。 19. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。 20. 取5 μl DNA洗脱液用琼脂糖电泳进行检测 20. 取10 μl DNA洗脱液用分光光度计检测其浓度及纯度，其余-20保存 实验二 基于16S rRNA基因的PCR扩增、电泳和回收 一、实验目的 1. 了解PCR扩增DNA的技术及原理； 2. 学习PCR扩增仪的使用； 3. 学习琼脂糖凝胶的制备和电泳方法； 4. 了解DNA胶回收的原理及方法。 二、实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，16S rDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。 细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16S rRNA 的基因，长度为1540bp，相比较5S rRNA和23S rRNA而言