凝胶电泳相关知识..docxVIP

凝胶电泳（GE）　凝胶电泳（英语：Gel electrophoresis）或称胶体电泳 是一大类技术，被/view/3805.htm \t _blank科学工作者用于分离不同/view/2505.htm \t _blank物理性质（如大小、形状、/view/26521.htm \t _blank等电点等）的分子。凝胶/view/25110.htm \t _blank电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、/view/6724.htm \t _blank克隆技术、DNA测序或者/view/630511.htm \t _blank免疫印迹）检测之前部分提纯分子。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如/view/930763.htm \t _blank密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料/view/1351036.htm \t _blank溴化乙啶(Ethidium bromide, /view/48988.htm \t _blankEB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的/view/758.htm \t _blankDNA条带,用于以后的/view/1364.htm \t _blank克隆技术操作。　凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学：　1.大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 　2.蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行（SDS），或者非变性凝胶电泳，或二维电泳。 　3.毛细管电泳 　4.酶谱法（zymography） 　5.变性梯度胶凝电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE） 　/view/996306.htm \t _blank琼脂糖和/view/193497.htm \t _blank聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在/view/63151.htm \t _blank电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 　1、 DNA的分子大小: 　线状双链DNA分子在一定浓度/view/1035220.htm \t _blank琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 　2、 琼脂糖浓度　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 　3、 DNA分子的构象 　DNA分子处于不同/view/25122.htm \t _blank构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,/view/1521981.htm \t _blank超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 　4、 电源电压 　在低/view/10954.htm \t _blank电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段姆直媛蚀锏阶畲?所加电压不得