引物设计部分使用说明(初学者超级推荐)解析.ppt

Stability Per 5-mer Oligo 6.44 使用说明 主要功能：专门的引物设计软件 Oligo 6.44 启动界面 Open sequence file 3个弹出窗口 Melting temperature ?G Internal Stability Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。 用Oligo 设计引物时的3个标准 Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 ΔG 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低 选中引物 上游引物 下游引物 只是示意图 引物分析 首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。 引物分析 二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。 引物分析 第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。 第四False priming 检查 引物分析 Key information of primer Hairpin Dimer and cross Dimer GC% Total PCR information Final PCR information Search for primer using Oligo 6.44 Search primer Online primer3 service / hkjadsjkdjkadkjajkdfa * PCR引物设计及相关软件使用 主要内容 背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍 PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。 PCR引物设计 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。 具体因素 一般原则 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点 Tm值的计算 一般的公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ） 一般原则 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。  一般原则 3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太