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质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）?一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和 θ 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。图 3-1 是其复制其始示意图。在复制时，首先合成前 RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的 RNAⅠ可控制 RNAⅡ形成二级结构，同时Rop增强 RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱 RNAⅠ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。图 3-1 带 pMB1（或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。表 3-1?：质粒载体及其拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322 及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的 pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101 及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20pUC系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。 pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA?聚合酶?Ⅰ，DNA?聚合酶?Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因?dnaB?、dnaC?、dnaD?和?danZ?的产物。因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有 pMB1（或 ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚 2～3 千个质粒。3．质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。4．转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因mob?，转移基因?tra?，顺式因子?bom?及其内部的转移缺口位点nic。二、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来，筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来。（一）选择标记抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene,?ampr）氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链 R-CO- 和主核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在 6-APA 中有一个饱和的噻唑环（A）和一个 β-内酰胺环， 6-APA 为由 L- 半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽。2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene,?Cmr,?cat）氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。cat?基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯