从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案..docVIP

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤植物体表面及水体中自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少 1. 繁殖快速:代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。 2. 生命力强:无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖)。 3.体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。 蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内加入15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2～7.4。加入琼脂,加热煮沸使琼脂溶化。～校正pH至7.2～7.4K2HPO4 0.2 校正pH 7.2～7.47.2～7.4西蒙氏柠檬酸盐培养基氯化钠硫酸镁(MgSO4·7H2O)磷酸二氢铵磷酸氢二钾柠檬酸琼脂2溴麝香草酚蓝溶液4pH6.8 先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分装试管，121℃高温灭菌15min。 4.8 配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.8~7.0 4.9耐盐培养基（%）： ①蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水 ②蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水 ③蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水 ④蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水 加入15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2～7.4。加入琼脂,加热煮沸使琼脂溶化。95%乙醇; 芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯 吲哚试验：乙醚、吲哚试剂 V.P.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚， 淀粉酶活力测定：1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂 4.11 仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环 无菌培养皿 土样 三角瓶 烧杯 洗瓶 玻棒 试管 酒精灯 擦镜纸 接种环 酒精灯 载玻片 吸水纸等。 恒温摇床 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌箱 超净工作台 水浴箱 紫外灯照射箱 磁力搅拌器 玻璃珠 移液管 涂布器 显微镜 五、实验方法及步骤 1、初筛方法 ①制菌悬液：两个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。每个环境的土样装1个锥形瓶，共2个，同时将其分为4组，编号AB。 ②加热筛选有芽孢的菌：将2个锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置100℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持15min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液 ③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，用相同的移液枪头由浓到稀来稀释。 ④涂布平板 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。37℃下恒温培养24h。 2、复筛方法【1】 划线接种（分区划线法）：在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线，先在