石蜡切片--ZH课件.pptVIP

石蜡切片（Ⅰ、Ⅱ） 【实验目的】 掌握石蜡切片的制作过程 掌握HE染色的基本原理和染色方法 【实验原理】 用石蜡渗透固化组织 用碱性染料如苏木精、碱性品红等，使细胞核着色 用酸性染料如伊红、酸性品红等，使细胞中的嗜酸性成分着色，如蛋白质。 【材料与器材】 材料：鼠肝 试剂：卡诺固定液，苏木精染液，1%盐酸乙醇液，各级乙醇，二甲苯，石蜡 器材：切片机，恒温箱，解剖刀，镊子，酒精灯，包埋纸盒，染色缸，水盘，小台木等。 【实验过程】石蜡切片Ⅰ 取材 固定 洗涤 脱水 透明 透蜡 包埋 切片 贴片 石蜡切片Ⅱ 脱蜡复水 染色 水洗 分化 漂洗 脱水Ⅰ 复染 脱水Ⅱ 透明 封藏 1、取材：剪取组织5mm×5mm×2mm。动作要迅速。 2、固定：生理盐水洗后，立即投入卡诺固定液固定30~50min。 3、洗涤：常用水洗涤或50%～70%乙醇冲洗。 4、脱水：70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两次，每次20min。※注意：更换高一级的脱水剂时要用吸水纸将器皿内的余液吸尽。 5、透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯30min（或至透明为止），须换一次二甲苯。 6、透蜡：放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20～30min。 7、包埋：将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。 8、切片 将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。 摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 刀片与石蜡切片约成15度左右。 厚度一般为4～10微米。 切成的蜡带到20～30cm长时，用另毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。 包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上。 9、贴片 ①、取一载玻片，滴一滴粘片剂用手指涂抹， ②、滴1～2滴的蒸馏水载玻片上。 ③、用小镊子夹取蜡带，放在水面上，蜡片光亮面贴于玻片上，稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。 ④、酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。 ⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。 10、脱蜡复水 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5～10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3～5min，再放入蒸馏水中3min。 染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。 11、染色 切片放入苏木精中染色约10～30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。 12、水洗 用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。 13、分化 就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。 14、漂洗 切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。 15、脱水Ⅰ 切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3～5min。 16、复染 用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。 17、脱水Ⅱ 放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3～5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。 18、透明 切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3～5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。 19、封藏：中性树胶封存 切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶