3,5—二硝基水杨酸法测定还原糖解析.ppt

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在 540nm 波长下测定光密度值查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。 3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖 掌握还原糖定量测定的原理和方法 。 掌握分光光度计的使用。 一、实 验 目 的 还原糖的测定是糖的定量测定的基本方法。 还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。 单糖均为还原性糖，双糖不一定是还原性糖，其中乳糖和麦芽糖为还原性糖，蔗糖和淀粉为非还原性糖。 利用糖的溶解度不同，可将样品中的单糖、双糖、多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定。再分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 二、实验原理 二、实验原理 （一）仪器 小麦面粉、pH 试纸、容量瓶、玻璃漏斗、移液管、量筒、试管、沸水浴锅 （二）试剂 （1）6mol/l HCl 和 6mol/l NaOH溶液 （2）1mg/ml葡萄糖溶液 准确称取 80℃烘干恒重的分析纯葡萄糖 0.1g，置于小烧杯中加入少量蒸馏水溶解后，移到 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定溶至 100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。 三、试剂与仪器 （3）3，5—二硝基水杨酸 把 6.3g3，5—二硝基水杨酸溶于 262ml 2 mol/l 的氢氧化钠中将此溶液与500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，充分搅拌溶解待溶液冷却后，用水稀释到 1000ml，存储于棕色瓶中。 三、试剂与仪器 四、操作步骤 （一）葡萄糖标准曲线的绘制 1.按下表制备 9 个管 2.向九支试管中分别加入 0.5mlDNS 试剂，充分混合。 3.将九支试管放入沸水浴中加热煮沸 5min。 4.将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。 5.向试管中分别加入 4ml 蒸馏水，充分混合。 6.以空白试管试管作对照，于 540nm 波长下，分别测定各管 OD 值并记录。 7.以每管的吸收值即 OD 值为纵坐标，相对应管的葡萄糖浓度为横坐标作图，得到一条直线，该直线通过零点。 四、操作步骤 （二）还原糖抽提液的制备 1.称取 2g 小麦粉，把它放入一个 100ml 的烧杯中，然后加入 50—60ml 蒸馏水，搅拌均匀。 2.把烧杯放入一个 50℃水浴中保温 30min。 3.拿出烧杯，将烧杯内含物转入一个 100ml 容量瓶中，加水至刻度，充分混匀，过滤之，（滤出液用于测定还原糖）即得还原糖抽提液。 四、操作步骤 （三）样品的酸水解和总糖抽提液的制备 1.把 1g 小麦粉溶于 15ml 水中并加入 10ml 6N 的盐酸溶液混合。 2.将烧杯放入沸水浴中加热煮沸 30min 后，冷却。 3.加入 6N 的氢氧化钠中和烧杯内含物。 4.将中和后的溶液转入一个 100ml 的容量瓶中，加水至刻度，充分混匀。 5.将容量瓶中的溶液过滤。 6.取 1ml 滤出液加水至 10ml，即得总糖的抽提液。 四、操作步骤 （四）小麦样品中总糖和还原糖的测定 1.取3支试管，编号分别为 1-3 ，按下表向每支试管中加入试剂。 2.将3支试管放入沸水浴中加热煮沸 5min后，冷却。 3.以空白试管（1号管）作对照，于 540nm 波长下，分别测定各管 OD 值并记录。 四、操作步骤 4 4 4.5 水（ml） 0.5 0.5 0.5 DNS(ml) 0.5 0 0 总糖抽提液（ml） 0 0.5 0 还原糖抽提液（ml） 3 2 1 管号 试剂 1、葡萄糖的标准曲线 五、计算 五、计算 从曲线中算出还原糖的浓度（mg/ml） x v x100 还原糖%= ----------------------------------------------- 样品中mg数 从曲线中算出总糖的浓度（mg/ml）x v x100x0.9 总糖%= ------------------------------------------------样品中mg数 N:稀释倍数 注：由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一个水分子，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。 * * VA易氧化，遇热和光更易氧化，加热和暴晒食品，VA大量破坏。 脂溶性维生素：维生素Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ等；均溶于脂类溶剂，不溶于水，在食物中通