第二章纯培养和显微概论.ppt

蚌埠学院 食品与生物工程系 * 革兰氏染色法 The Gram-stain technique was developed by the Danish bacteriologist Christian Gram in 1884. It divides bacteria into 2 groups, Gram-positive (G﹢) and the Gram-negative (G﹣) 1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染 2、用碘液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用，使二者结合得更牢固。 3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。 4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 注意：染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上； 二是增加其对染料的亲和力。 常用固定方法：酒精灯火焰加热和化学固定。 固定时应注意尽量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 蚌埠学院 食品与生物工程系 * Gram stain of G+ Staphylococcus cells. Gram stain of G- E. coli cells 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌革兰氏染色结果 2、电子显微镜的制样 生物样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱水，失去样品原有的空间构型。 由于构成生物样品的主要元素对电子的散射与吸收的能力均较弱，在制样时一般都需要采用重金属盐染色或喷镀，以提高其在电镜下的反差，形成明暗清晰的电子图象。 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 透射电镜的样品制备 电子的穿透能力有限，因此透射电镜采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。 最常用的载网是铜网，也有用不锈钢、金、银、镍等其它金属材料制备的载网。 支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。 常用的制样技术：负染技术、投影技术、超薄切片技术 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 扫描电镜的样品制备 STM的样品制备方法比TEM要简单，它主要要求样品干燥，并且表面能够导电。 对大多数生物材料来说，细胞含有大量的水分，表面不导电，所以观察前必须进行处理，去除水分，对表面喷镀金属导电层。 保持样品形状的主要关键是样品干燥。 干燥方法有自然干燥、真空干燥、冷冻干燥和临界点干燥等，其中临界点干燥的效果最好。 干燥、喷镀金属层后的样品便可用于观察。 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 思考题 1.为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？ 　 2.微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微观察中（光镜和电镜）通过改变样品的反差以改善观察效果的技术及方法。 　 3.试找到一篇使用微生物照片的文献，分析该文为什么要使 用微生物照片，采用的是何种显微观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪些技术获得？ 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 谢 谢 实际上，标本各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，导致光波相位的改变（即出现相位差）。这就是相差的来源。光的相位差肉眼无法感觉，那麽相差显微镜是如何让人的眼睛感受到相位差的变化？具体表现在颜色上还是表现在明亮程度上的变化呢？ 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 相差显微镜配备了特殊的光学装置，主要是环状光圈和相板。（位置以及作用） 环状光圈 相板（相差物镜头， Ph) 调焦望远镜 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差（实际上，相位推迟1/20波长时，合成波的变化就已经较明显，可以被识别）。由于反差的基础是细胞不同部位的密度差异，因此相差显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构。此技术突破使其发明人F. Zernike 获得了1953年的诺贝尔物理学奖。 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 观察结果比较 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 观察结果比较 蚌埠学院 食品与生物工程系 * 4.荧光显微镜 细胞中有些物