胶原蛋白的提取胶原蛋白的提取.docVIP

Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其 抗UVA氧化损伤作用的初步研究 学科专业：动 物 学 研究方向：生化制药 指导教师：魏泓 教授 研 究 生：王 琳（2001345） 内 容 摘 要 本文围绕Ⅰ型胶原蛋白（CPⅠ）的制备及其理化性质进行研究，同时在其防止长波紫外线（UVA）对细胞的要用于填充深的皱纹，皮肤损伤造成的缺损（如青春痘疤）和修补脸形的缺陷等。其效果立竿见影，但注射到皮肤内的胶元蛋白会被人体逐渐吸收，因此其功效只能维持半年至一年，而且少数人群可能会出现过敏氧化损伤方面进行了初步探索，为CPⅠ的进一步研发提供理论基础和科学依据。 以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CPⅠ的分离纯化。 CPⅠ理化性质鉴定结果表明：样品在223 nm处有紫外最大吸收值；含有十八种氨基酸，氨基酸总量在90%以上；样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml；SDS测定CPⅠ由α、β、γ三条链组成；色谱分析纯度约为100%。通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CPⅠ进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿情况；细胞毒性小于Ⅰ级，结果证明本方法制备的CPⅠ无毒副作用。 评价CPⅠ对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。结果表明：随着UVA照射时间的延长，细胞的活性明显降低，说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的，其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。加入不同浓度的CPⅠ后照射同样的时间，MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高，其中50%CPⅠ组的效果极为显著（P﹤0.01）。提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。 综上所述，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯化CPⅠ，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。 关键词：Ⅰ型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤 Studies on the preparation，identification of CPⅠand its protective effect on cells damaged by UVA Major : Biology Speciality : Zoology Tutor : Prof. Wei Hong Author : Wang Lin（2001345） Abstract In this paper,how to prepare CPⅠand identify physico-chemical property had been studied, and UVA oxidative damage L929 was perliminary discussed. These datas provided theoretic foundation and scientific proof for further research and development of this product. Pigskin was used as material. According to the comparation among the three kinds of crude extraction methods including acid dissolve,enzymolysis and neutral salt solution. The method of enzymolysis combined with HPLC was chosen to prepare CPⅠ. The physico-chemical property of CPⅠwas identified. The results showed that: CPⅠshowed character absorption peak at 223nm; CPⅠhad 18 kinds of amino acids, total count of amino acid was more than 90%; the concentration of protein was 1.03 mg/ml; CPⅠwas composed of αchain,βchain and γchain by SDS; O