CRISPR简介例析.doc

自私基因元件（Selfish genetic eleent）对于原核生物（prokaryote）可不一定是一无是处的。我们都知道病毒可以通过重编程宿主细胞（reprogramming host cell）的方式进行大量复制，也可以像“偷渡客”一样整合到宿主细胞的基因组里潜伏起来伺机作乱；可接合质粒（conjugative plasmid，又称作转移性染色质外DNA）可以赋予宿主细胞新的优势特性，比如获得某种抗毒素因子，这样细胞就会像吸毒上瘾一样不愿意丢失这些质粒，还有很多这类外来DNA赖在细菌等细胞中不走的事例这里就不一一介绍了。不过细菌（bacteria）和古细菌（archaea）都有一套防御机制抵御这种外来的侵入性因子，这种防御机制就是在成簇的、有规律间隔的多次重复短片段（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）的基础上建立起来的适应性免疫系统（adaptive immune system）。Jinek等人必威体育精装版的研究成果发现，细菌细胞里的CRISPR效应酶蛋白Cas9因子不是通过一个RNA，而是一对小RNA分子来清除入侵的外源DNA片段。 CRISPR系统能够将各种外源的病毒或质粒DNA短片段“集中”到细胞基因组里某个特定的重复片段区域上，将这些外源DNA当作细胞曾经经受过外源DNA入侵的一种记忆给储存起来。然后这段DNA会转录生成CRISPR前体RNA（precursor CRISPR RNA），前体RNA生成之后会被切割成一段一段的重复RNA片段，这些小RNA分子就是成熟的CRISPR RNA（crRNA）。然后crRNA会招募CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）与各种被细胞记住的外源的入侵DNA或mRNA片段结合，将它们彻底摧毁。 科学家们是在大约5年前才开始了解到CRISPR的，当时他们发现如果将某种病毒的DNA片段掺入细菌之中，细菌就会对随后再次感染的同种病毒产生极高的免疫力。细菌就是从之前入侵的病毒DNA片段那里认识了这种病毒，从而获得了免疫力，当病毒再次入侵的时候细菌编码的Cas9因子就可以发挥作用，消灭来犯的病毒。但是当时还不清楚这种Cas9因子的具体作用机制。 科学家们首先需要解决的问题就是搞清楚Cas9因子是如何获得成熟的crRNA的。在大部分CRISPR-Cas系统里都少不了这样一位主角，那就是将CRISPR前体RNA切割成一小段一小段小RNA分子的专一性核酶（nuclease）。除了成熟的crRNA之外，这些Cas9因子还需要另外一种CRISPR特异性的小RNA（CRISPR-specific small RNA）的帮助，我们把这种小RNA称作反式激活的crRNA（tracrRNA），因为这种小RNA刚好与crRNA的小片段互补，同时它们还是RNA特异性的宿主核糖核酸酶RNase III的底物。经过RNase III的切割之后，这一对互补的RNA（其中包括一条42bp的crRNA和一条75bp的tracrRNA）就可以充当Cas9因子的向导，帮助它“打鬼子”了。 Jinek等人就在此基础之上继续进行了更深入的研究，他们发现化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）编码的Cas9蛋白也能够与细菌熟悉的入侵DNA结合，并将其降解。虽然我们知道切割位点只能由crRNA决定，但是科学家们却惊奇地发现，Cas9蛋白与目标DNA结合以及切割的过程还必须有tracrRNA分子的参与。也就是说，tracrRNA分子能够帮助Cas9-crRNA复合体在细胞复杂的DNA环境中精准地定位到入侵的DNA序列上，如附图所示。这也进一步说明小RNA分子的确是细胞里不可或缺的一份子。 ? 瑞士军刀样的多功能蛋白。（A）Cas9蛋白需要crRNA和tracrRNA的共同帮助才能识别入侵的外来DNA分子，与之结合并将其降解。因为crRNA中的向导链部分可以与外源DNA的一条链互补并结合形成R环结构。在被识别区域两端的DNA基序也起到了非常重要的作用，它们可以帮助DNA链结旋打开双链，有利于crRNA链侵入。然后靶标DNA会在Cas9蛋白两个核酶结构域的作用下被切断。（B）级联反应复合体里含有一个crRNA，可是却最多携带了5种不同的Cas蛋白。所以它能够持续不断地招募核酶和解旋酶Cas3蛋白，不停歇地将入侵的外源DNA打开并切断。 ?Cas9蛋白能够凭借分子内的两个核酸酶结构域切割靶标DNA分子，形成平末端产物，其中每一个结构域负责切割靶标DNA分子R环状（R-loop）结构中的一条DNA链，具体来说，就是一个HNH核酶结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，