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项目十二　 酶免疫技术 一、酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay) 【实验原理】 酶联免疫吸附试验(ELISA)为一固相酶免疫测定技术，先将已知抗原或抗体包被于固相载体表面，与待检样品中的相应抗体或抗原发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合，最后加入酶反应底物，根据产物颜色深钱或测定吸光度(A)值，可进行定性或定量分析。实验的方法类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。本试验只介绍间接法和双抗体夹心法。 (一)间接法 【试剂和器材】 1．PBS (pH7.4，0.01mol/L) 取81.0 ml 0.2 mol/L Na2HPO4，加入19.0 ml 0.2mol/L NaH2PO4和17g NaCl，再加入蒸馏水1900 ml混匀即可。 2．包被缓冲液 pH 7.4 0.01 mol/L PBS，其中加入终浓度为0.1g/L的柳硫汞。 3．洗涤液 pH 7.4 0.01 mol/L PBS，加入终浓度为0.05%的Tween-20 。 4．封闭液 含1%牛血清白蛋白 (BSA)的洗涤液。 5．稀释液 含0.25% BSA的洗涤液。 6．底物缓冲液(pH5.0) 取0.2mol/L Na2HPO4 25.75 ml，加入0.1mol/L柠檬酸24.25 ml。 7．底物溶液 取40mg邻苯二胺(OPD)溶于100ml 底物缓冲液中, 加入40μl 30% H2O2。临用时配制，该底物对光敏感，须避光保存。 8．终止液 0.5 mol/L H2SO4。 9．混合正常人血清、兔抗人全血清、正常兔血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体。 10．聚氯乙烯酶标板、微量移液器、试管、湿盒、酶标仪、微量震荡器。 【步骤和方法】 1．包被 将混合正常人血清用包被缓冲液1:400稀释，加于酶标板中，每孔100μl，置4℃16~18h。 2．封闭 弃去包被液，每孔加入封闭液200μl，置湿盒，37℃2~3h。用洗涤液洗涤3次，每次2~3min。 3．加样 用稀释液将兔抗人全血清做1:50~1:12800系列倍比稀释，将正常兔血清做1:100稀释，分别加入板孔中，并同时设立空白对照孔(加入稀释液)，每孔100μl，震荡混匀30s，置37℃30~60 min。同上用洗涤液洗3次。 4．加酶标抗体 将酶标抗体用稀释液适当稀释，每孔加100μl，震荡混匀，置37℃30~60min，用洗涤液洗3次。 5．显色 每孔加入底物溶液100μl，室温避光反应10~30min，每孔加入终止液 50μl。 【结果判定】 1．肉眼观察样本孔颜色较明显深于阴性对照孔为阳性。 2．用酶标仪测各孔A492值，测定孔与阴性孔A比值≥2.1为阳性。 3．以终点滴度报告结果。 【注意事项】 1．必须注意固相载体的选择， 要求板孔之间在同样反应条件下颜色反应的吸光度值的偏差在平均吸光度的±10%以内，阳性和阴性标本的颜色反应要相差明显，吸光度值相差应至少10倍。通常聚氯乙烯吸附蛋白质的能力高于聚苯乙烯。 2．应选用质量稳定的酶标抗体，注意保存，避免反复冻融。 3．洗涤应彻底，将液体甩掉，并在吸水纸上将残液磕净，加样不要有气泡。 4．实验条件应统一，并做好阴性、阳性及参考品对照。 【方法评价】 敏感性高，特异性强，稳定性较好，操作简便，结果容易观察，方法易于推广。 【临床意义】 常用于抗体的定性或定量检测。 (二)双抗体夹心法 本试验以测定癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)为例，介绍双抗体夹心法。 　 【试剂和器材】 1．标本 待检血清 2．试剂盒 (1)已包被CEA抗体的反应板一块。 (2)洗涤液 粉剂一包(溶于300ml蒸馏水中，加吐温-20 1支，混匀即成洗涤液)。 　 (3)吐温-20。 (4)酶标记CEA 抗体1 支(稀释液1瓶)。 　 (5)底物溶液及底物缓冲液。 　 (6)癌胚抗原参考标准、阴性和阳性对照血清各１瓶。 (7)终止液。 　 3．器材 试管、微量加样器、塑料吸头、水平快速震荡器、酶标测定仪、 恒温水浴箱、湿盒及滤纸等。 　　【步骤和方法】 1．取出包被的反应板，各孔内注入洗涤液，置3min，甩掉液体。反复洗涤３次