DNA印迹原理.docVIP

? ? DNA印迹原理：用合适的限制性内切酶消化DNA，电泳分离DNA片段，利用毛细作用，使液体经过凝胶，使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面（NCM），然后进行杂交。?作用：检测待定基因的大小、拷贝数、变异等。? 步骤：DNA的抽提、质量检测；限制性内切酶操作；DNA的琼脂糖凝胶电泳分离、0.4N?NaOH变性；转膜（毛细管渗吸或电转移）；80℃处理或紫外线照射将DNA固定在膜上；探针制备、检测等。? 应用/意义：①特定基因定性定量检测；②基因突变分析；③酶切图谱分析；④基因重排和丢失检测。? Northern?blotting? 步骤：RNA(mRNA)提取，限制性内切酶消化，变性凝胶电泳分离RNA片段，转膜，预杂交，杂交，放射自显影。应用：RNA的定性定量研究，mRNA表达高低，癌基因、抑癌基因活化。?补充：? southwestern?blotting：该方法结合了western?blot和Southern?blot两种试验方法而发展起来的检测与特意DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法。基本原理：细胞核蛋白提取物经过SDS后，转移至NCM上，然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。? Immunochemistry：基本原理：应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。?? ??PCR基本工作原理？反应三步骤？应用？在医学上具体应用？成败的关键因素？? PCR聚合酶链反应：又叫无细胞分子克隆、体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。? PCR基本原理：是以体外酶促反应的方式，模拟天然的DNA复制过程。以待扩增DNA片段为模版，根据其5’-3’端的核苷酸顺序，设计一对与之互补的寡核苷酸为引物，模版DNA高温变性解链，低温退火，引物与摸板DNA单链的互补顺序结合，中温条件下，通过Taq?DNA聚合酶作用，以四种dNTP为原料，单链DNA模版逐步延伸，合成新的DNA互补链。这样的三步反应为一个周期，每一周期产物又可作为新模板进行新的合成反应。n次循环后，拷贝数增加2n倍。一般经过25~30个循环，拷贝数可扩增上百万倍。经过电泳、染色，可直接观察待测基因存在与否，不需要与基因探针分子杂交。?常见几种PCR：逆转录PCR（RT-PCR）；巢式?PCR；RACE；反向PCR；定量PCR--real?time?PCR；半定量PCR。?PCR的基本反应步骤：高温变性、低温退火、中温延伸。? ①?高温变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链变成单链；? ②?低温退火/复性：降低温度至37~56℃（Tm-5℃）使引物与模板DNA单链结合；? ③?中温延伸：将温度升至72℃，Taq?DNA聚合酶以dNTP为底物，催化合成一条与模板互补的新链（在引物3’端进行延伸），使原模板DNA的一条链变成两条链。? PCR应用：扩增基因，cDNA文库及筛选，直接测序，染色体特异区带片段克隆，检测突变，简并引物扩增未知序列，标记探针。? 医学上具体应用：病原体的检测，遗传病基因诊断，肿瘤相关基因诊断，组织配型，法医、亲子鉴定。?成败的关键因素：?? ??实时PCR/荧光定量PCR？原理？优点？与普通PCR的不同及优势？?Realtime?PCR/实时PCR/荧光定量PCR：是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对位未知的模板进行定量分析的方法。?原理：?1、在Taqman寡核苷酸探针的5’端标记一个报告荧光染料，3’端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料发射的荧光信号被猝灭染料吸收→不发光。? 2、PCR产物扩增时，Taq酶遇到了结合在模板上的Taqman寡核苷酸探针，其5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告染料与猝灭染料分离，荧光共振能量转移不再发生，报告荧光发射的荧光强度与被切掉的 ? ? 探针成正比。实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，由此可以计算PCR产物的含量。? 3、如果用相同模板量的不同样本进行Taqman?PCR扩增时，相同时间分析荧光强度可以发现产物含量的差异，这实际上是基因模板含量不同所致，由此可以推测基因拷贝数的变化情况。? 优点：准确定量结果；特异性更高；闭管操作防止污染；全自动化反应、数据收集和分析；无需凝胶电泳；高通量；阳性内参照防止假阴性结果。?? ??基因治疗的主要策略？步骤？?基因治疗：是指从DNA水平所采取的一切治疗措施和新技术。例如向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷；或采用特定