酶的浓缩干燥.doc

九、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 等电聚焦电泳 此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 1）电场强度是指每厘米距离的电压降。 根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳（20200 V/cm ）和常压电泳（2～10V/cm ）。 2）溶液的pH值: 溶液的pH值决定了溶液中颗粒分子的解离程度，也就是决定了颗粒分子所带净电荷的多少。 3）溶液的离子强度: 溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。一般电泳溶液的离子强度为0.02～0.2 较为适宜。 4）电渗: 在电场中， 溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。 此外，缓冲液的粘度和温度也对颗粒的泳动速度有一定影响。 酶学研究中，电泳主要用于：酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定、少量酶的分离纯化。 1、凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳） 是以具有网状结构的多孔凝胶（聚丙烯酰胺）为支持体，不同电荷、不同大小生物大分子在电场的作用下，发生迁移，具有电泳和分子筛的双重作用，即迁移率取决于所带电荷和分子大小形状。 丙烯酰胺为单体，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在化学催化剂（过硫酸铵和四甲基乙二胺—TEMED）或光聚合催化剂（核黄素）的作用下，聚合而成。 单体（聚丙烯酰胺）浓度越高，凝胶孔径越小；交联剂浓度越大，凝胶孔径越小。 PAGE常用于鉴别蛋白的纯度。 2、SDS-凝胶电泳 在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入1-2%的十二烷基硫酸钠（SDS），即成SDS-聚丙烯酰胺凝胶。当蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，蛋白质分子在SDS-凝胶电泳中的迁移率主要取决于分子量大小，而与分子形状和所带电荷无关。 常用于鉴别蛋白质的分子量。 蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白中的二硫键还原而打开，SDS使蛋白质的氢键、疏水键破坏，使蛋白质变性解聚。 在一定条件下，1.4gSDS与1g蛋白质或亚基结合，形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS为阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上的大量阴离子掩盖了蛋白质之间电荷的差别； SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成了长椭圆形，其短轴长度都为18A左右，而其长轴长度与蛋白质分子量成正比，因此蛋白质的迁移率只与分子量大小有关。 SDS-凝胶电泳 3、等电聚焦电泳(IEF) 原理：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。 在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 两性电解质 是许多异构和同系物的混合物，是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。其pH分布在2.5~10之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。 两性电解质特点： 1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 十、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。 萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。 按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。 1、有机溶剂萃取 用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；用苯酚萃取RNA等。 由于有机溶剂容易引起酶蛋白和酶RNA的变性失活，所以在酶的萃取过程中，应在0~10℃的低温条件下进行，并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。 2、双水相萃取 是利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。 将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时（或者是某种聚合物溶液和盐溶液），当聚合物浓度达到一定值（阈水平Threshold level）， 体系会自然的分成互不相混溶的两相，这就是双水相体系。 此两相中任何一相都含有较高的水分。细胞碎片、多糖、核酸以及酶的性质不同，在两相中的分配情况亦不同，在多数情况下，酶可与这些杂质迅速而有效地分离。 双水相形成原因 由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。 一般认为只要两聚合物水溶液的