分子生物学实验-2015.6分析报告.ppt

分子生物学实验概述 DNA: 脱氧核糖核酸 RNA: 核糖核酸 蛋白质：氨基酸-肽链-生物大分子 染色体：由DNA和蛋白质，少量RNA组成 染色质：是间期遗传物质的存在形式 分子生物学：在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。（基因水平) DNA DNA抽提 RNA RNA抽提 核酸杂交 质粒和载体 PCR Q-PCR 探针 质粒抽提，载体构建 RNA种类 mRNA tRNA rRNA microRNA(miRNA) dsRNA siRNA(降解mRNA) shRNA LncRNA 中心法则（基因的表达） 遗传信息的传递是： DNA→RNA→多肽(蛋白质) 在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白质 DNA的抽提 酚抽提法 基本原理： 用SDS和蛋白酶K破坏和消化细胞 用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质 通过盐和乙醇沉淀获得DNA。 试剂：蛋白酶K（merck） 试剂盒：omega 、百泰克、天根、华顺等 。（血液/组织） PCR (polymerase chain reaction ) 定义： PCR 译为多聚酶链式反应。是一种在体外扩增DNA特异片段的技术，可在短时间内获得大量（数百万个）DNA特异序列的拷贝。 步骤 ： （1）变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA。 （2）退火（annealling）：当温度突然降低到适当温度时，引物与DNA模板上的特异序列，按碱基互补原则，形成杂交双链。 （3）延伸（extension）：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg2+存在条件下，以引物为起始点，按5′→3′方向催化合成一条与模板互补的新链。 分子生物学中主要应用： ①克隆：扩增目的基因，将目的基因连接到质粒上。 ② DNA序列的测定 PCR的反应体系 Marker：fermentas / takara 纯化试剂盒:NEB、omega 、百泰克、天根、华顺等。 琼脂糖：西班牙、sigma 等 Taq 酶（复能） RNA的分离与纯化 Trizol试剂： 酚:使核酸与核蛋白分离、变性沉淀蛋白质，抑制RNase活性。 异硫氰酸胍：破坏裂解细胞，使核酸与核蛋白分离，变性沉淀蛋白质，同是具有很强的RNase抑制作用。 DEPC（二乙基焦碳酸盐）：对核酸酶有很强的抑制作用。 RNA提取试剂盒（QIAGEN） axygen 盒装枪头 Q –PCR（Real-time Quantitative PCR） RT –PCR (Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction）：即逆转录PCR Q-RT-PCR=Q-PCR RNA （反转录试剂盒：fermentas / takara等） SYBR Green ( 荧光染料法) （Roche） Taqman （探针法） 内参 引物（复能） cDNA 载体(Vector) 定义：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的环状DNA分子。 种类：质粒、噬菌体、病毒等 共同特点： 环状DNA 都能专一感染某一类细胞； 具有某种选择性标记； 都具有一些内切酶位点； 随着染色体的复制而复制，随着细胞分裂而扩增。 结构： 抗性基因（Ampicillin, Kanamycine gene) 启始复制子（ori,) 多克隆位点(MSCor polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。 空载体和成熟载体（复能） 空载体（ 内切酶，连接酶-复能） 质粒 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 核酸探针 定义：是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探 针、寡核苷酸探针 选择：寡核苷酸探针，带有标记物 特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低 探针标记物 有放射性核素：32P、35S、3H、125I、131