8-CHO细胞药物处理离心后中间纤维的免疫酶标染色.doc

报告成绩 实时记录成绩 实验八 CHO细胞药物处理离心后中间纤维的免疫酶标染色 学生姓名 学号 班级 座位号： 同组同学 日期： 年 月 日 备注： 【Introduction】 细胞免疫化学技术及其应用： 免疫标记技术：将既容易被检测又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量[1]。 免疫荧光技术——步骤简单，特异、灵敏、快速，在多重标记中应用更方便；但荧光抗体染色标本不能长期保存，需用荧光显微镜观察。 免疫酶标技术——能克服免疫荧光技术的不足，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。对组织细胞的细微结构分辨不清。 免疫电镜技术——用酶标抗体与组织或细胞抗原结合，显色后在电镜下观察。免疫反应特异性与电镜高分辨力结合。可观察亚细胞水平和超微结构，高精确度、高灵敏度。 免疫电泳技术：将琼脂电泳与免疫扩散相结合的一种常用的免疫学实验方法，具有抗原抗体反应的高度特异性，电泳分离技术的快速，灵敏和高分辨力，以及实验设备和操作简便等优点。 实验要设立的对照和设立对照的重要性： 阳性对照（用已证实含有靶抗原的标本与待检标本做平行处理，结果应为阳性）； 阴性组织对照（用已证实不含靶抗原的标本做平行处理，结果应为阴性，排除假阳性）； 阴性自身对照（同一标本片上自身组织成分的阴性背景对照）； 阴性试剂对照（为证实特异性抗体试剂的有效性和可靠性而设计的同步对照，常用有空白对照和替代对照）； 设立对照用于判断是否受环境影响、结果是否可靠、是否有假阳性等等。 本实验的原理： 波形蛋白（Vimentin）是中间丝的其中一种蛋白质[2]。细胞经过预先处理并固定抗体又可以和结合，能纤维【Materials methods】 实验试剂：甲醇、丙酮6ml（－20℃）预冷；一抗、二抗和显色液；PBS-0.2％tritonX100。 实验操作： 1．准备：培养CHO细胞在小玻片上→秋水仙素处理、细胞松弛素→对照组以生理盐做同样处理。 2. 离心：标记 4. 丙酮固定：从冰箱中取出丙酮离心管，倒入另一小染色缸→取出玻片按顺序排放入→固定5min。 5. 清洗：甲醇回收→自来水冲洗染色缸→倒入PBS→按顺序放入玻片→洗3min共三次6. 贴擦镜纸：载玻片晾干→修剪擦镜纸→用镊子夹住擦镜纸一次性贴上。 7．加一抗：（1）载玻片放入湿盒中→在每个小玻片的擦镜纸上各滴加一抗→37℃孵育45min。 （2）小染色缸中加入PBS→夹取小玻片至小染色缸中，使擦镜纸自然脱落→夹出脱落的擦镜纸。洗5min共三次 10．观察：染色较深后→将小玻片在PBS中略洗→加盖玻片擦干→40倍镜观察。 【Results】 的，可以观察到形状网状结构，的细胞骨架。、二与特异性结合，了的位置和形态结构。【Discussion】 ：，观察到形状网状结构对照组的是无规则团块因为大部分细胞都分裂，呈现细胞的：的有：没有导致细胞不能。 答：实验流程都蛮顺畅的，但是贴擦镜纸那一较难，使细胞脱落可以多发一两片同步防止意外【Questions】是擦镜纸太大，抗体不够；或者显色液显色时间导致细胞脱落了 答： l：100 1：200 1：400 1：100 + + + +(+ +) + + + +(+ +) + + +(一) +(一) 1：200 + + + +(土) +++(一) + +(一) +(一) 1：400 + +(一) +(一) (一) (一) 【References】 [3]赵浩亮. 兔膝骨关节炎软骨细胞骨架的观察与研究[D].山西医科大学,2009. [4]黄宪高,余克伦,谢库. 一个稀释度间接ELISA法测定IBDV抗体效价的研究[J]. 广西农业大学学报,1994,04:309-313. 实验八 CHO细胞药物处理离心后中间纤维的免疫酶标染色 学生姓名 学号 班级 座位号： 同组同学 日期： 年 月 日 备注： 【】 具体步骤 备注