免疫组织化学染色技术20140413__培训课件.pptVIP

主讲人：王兴名 指导教师：王洪江 在此特别感谢我的导师王洪江老师及研究生科三位老师的指导与支持！谢谢。 * 超薄切片显示，兔胰岛中A细胞胞质内的内分泌颗粒上聚集有较多的金粒（第一抗体为胰高血糖素） 1.目前应用最为广泛 2.原理：抗原抗体反应，酶标记抗体，加底物显色 3.特色：准、清、久、兼容。 免疫酶标方法 1.标记物：特殊的金属颗粒-胶体金 2.特性：特别适用于电镜的单标记或多标记。也适用于光镜研究。 免疫胶体金技术 电子显微镜胶体金包埋后染色 四、免疫组化技术特点：（熟悉） 1.原位性 2.显色反应 3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强 6.敏感性高 原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面 2.显色反应 根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色 1.原位性 形态—显色反应 代谢、功能—抗原含量及位置 4.定性、定量及定位三位一体 存在吗？ 在哪里？ 有多少？ 3.形态、代谢和功能三结合 原理决定该特点 “免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！” 6、敏感度高 ABC法、SP法可使抗体稀释上千倍、上万倍后仍可与组织中抗原结合。 5.特异性强 小结 免疫组化技术的原理 用下图来说明以上基本原理： 免疫组化具体怎么做的呢？ Company Logo 第二节、第三节 免疫组织化学技术基本步骤（难点，实用性强） 二抗孵育 组织包埋 一抗孵育 封闭 抗原修复 灭活 组织脱蜡 显影 取材、固定 制片 结果判读 长 时间：标本离体后30min内取材，并用固定液固定； 目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原 方法：4%甲醛溶液 机理：使蛋白质发生交联而起固定作用 ,影响细胞膜通透性,抑制酶的消化作用，从而保护蛋白质免受破坏） 1.取材、固定 2.组织包埋 目的：使组织保持一定的形状和硬度, 易于切片 方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等 切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载玻片。 烤片： 70℃ 2h，目的---充分贴附 3.制片 4.脱蜡 脱蜡：二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二甲苯 水化、洗涤：PBS浸泡 5min 目的：暴露抗原,提高通透性,增强特异性染色 方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01M 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。 PBS洗涤 3次 5.灭活 6.抗原修复 3%H2O2溶液，室温10min，以消除内源性过氧化物酶的活性 目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清 适当比例稀释I抗，37℃孵育1h或4℃冰箱过夜。 PBS洗涤 2min*3次 7.血清封闭 封闭后勿洗涤！ 8.特异I抗孵育 9.II抗孵育 滴加生物素化II抗工作液50-100ul室温孵育20分钟，PBS洗涤2min*3次 11、滴加显色剂： 如DAB ，室温，5min左右。 注意：光镜下掌握染色时间； 流水冲洗 5min 10.滴加底物 采用的方法不同，底物有一定差异. 后面详细分析 11.滴加显色剂 苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化 12.复染 13.“成片” 流水充分冲洗 梯度酒精脱水 中性树胶固定，封片，晾干后镜检。 结果判读要考虑以下几个方面 A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细胞间质 B、阳性细胞数 C、染色强度 最后一步：结果判读 光学显微镜下结果判断判读举例： 食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳性表达，表达位置：细胞质 乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表达 在有转移的HCC中，VEGF呈强阳性表达 ABC ×200 人甲状腺癌CD44V6染色，胞膜阳性，SP法，DAB染色 ABC法 抗生物素-生物素免疫染色法 理论基础： 卵白素：亦程抗生物素，亲和素。有四个同生物素亲和力极高的结合点。 生物素：即机体内维生素H。 1.可以与卵白素高亲和力结合； 2.可以和抗体IgG的Fc段结合，但不影响抗体活性； 3.活化后可与过氧化物酶等结合，也不影响酶活性 ABC试剂盒 ABC试剂盒 1 .封闭用血清 2.生物素标记II抗 3.A试剂： 卵白素（抗生物素） 4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物 Biotinylated second antibody P-O P-O P-O P-O Antigen Biotin Avidin HRP Primar