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cDNA文库组标准流程
一. Total RNA的提取 1
二. mRNA的分离 6
三．cDNA双链合成 8
四．载体制备 11
五. cDNA双链和载体的连接 14
六．电转化流程 15
七．快速鉴定、菌落PCR 17
八．pBlueScript cDNA库扩增 19
一.Total RNA的提取
1.试剂配制
准备工作：
1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins?高压灭菌。
电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：
▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5
三水合柠檬酸纳 22.94g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：
肌氨酸钠 10g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：
0.78M柠檬酸钠 8.25ml
10%肌氨酸钠 12.375ml
异硫氰酸胍 118.05g
加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用
临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）
PH=4.5
NaAc·3H2O 13.6g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲3M醋酸钠 PH=5
NaAc·3H2O 20.4g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
4M LiCL:
LiCL 24.164g
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用
▲0.5M EDTA PH=8.0
EDTA 18.61g
用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用
▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):
MOPS 41.86g
NaAC·3H2O 4.10g
0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml
用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
1x MOPS:
10x MOPS 30ml
加DEPC水270ml，用时现配。
▲4x RNA Loading buffer:
10x MOPS 400ul
甘油（高压过） 200UL
溴酚兰 10ul
甲醛(37%) 72ul
去离子甲酰氨 310ul
EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul
ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul
在4℃ 可保持3个月
10x PBS
pH=7.4
NaCl 80g
KCl 2g
Na2HPO4 14.4g
KH2PO4 2.4g
定容至 1000ml
▲变性电泳胶：
称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液：
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml
2.动物组织total RNA的提取
根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml
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