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第3章 FACSComp软件 3.1 概述 FACSComp是BD公司自动设置仪器的应用软件，可通过标准微球（CaliBRITE beads）来监测仪器的工作状态，还可以为人类外周血淋巴细胞免疫分群的应用强直性脊椎炎提供常规的、自动化的仪器设置。流式细胞仪包含了一些灵敏的光电元件，为了保证实验结果的一致性，最好每天用CaliBRITE beads来运行FACSComp软件。已知光散射和荧光强度的标准塑料微球，大小在5-6 um 左右。 BD公司生产的beads包括下列种：无荧光标记unlabeled beads） FITC-标记 PE-标记 PerCP-标记 PerCP-CY5.5-标记微球（PerCP-CY5.5 beads）APC-标记每一种beads都有一个相应的6位编码（lot ID），例如，12493N。其中最后一位代码决定了下列值： FSC和SSC的最小separation values（unlabeled bea的后缀）FL1，FL2和FL3的最小separation values（FITC，PE，PerCP- bead的后缀）FL4 PMT的靶值（APC-bead的后缀）FL4的最小separation values（PerCP，APC-bead的后缀）CaliBRITE beads制成新鲜悬液。 BD FALCON流式管。 实验流程 3.3.1 制备标准微球 标准微球CaliBRITE beads请保存在4度 根据下表所示，准备两管标准管管1和管2：充分混合所有CaliBRITE beads，垂直向下滴一滴到鞘液中，混匀，待测 Unlabeled FITC PE PerCP 管1 (1 ml 鞘液) x 管2 (2 ml 鞘液) x x x x Unlabeled FITC PE PerCP APC 管1 (1 ml 鞘液) x x 管2 (2 ml 鞘液) x x x x x 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常。 显示屏下方的Dock菜单中选择FACSComp图标，并点击打开FACSComp软件，出现FACSComp主页面。 在 Sign In 窗口下：输入操作者，单位及实验室主任，其中操作者是必须的。然后以鼠标点击「Accept」，进入Set UP窗口。 在 Set Up 之窗口下：可进行确认每一次分析的数据： 分析模式选择：选择Lyse/WashLyse/Wash 用于溶血素洗涤的样本（两色、三色或四色）； Lyse/No-Wash 用于溶血处理后免洗的样本（三色或四色）； HLA-B27 用于做HLA-B27抗原检测的样本，它必须在Lyse/Wash检测成功的基础之上并用HLA-B27调试微球才可进行 输入CaliBRITE beads的批号：Unlabeled- beads/FITC- / PE- /PerCP-/APC-beads的批号。 注意beads批号为六位编码，最后一位为大写字母。 选择存储文件，确认需要存储的文件前打(。 勾选自动储存。 然后点击「Run」，软件进入PMT窗口 在 PMT 窗口下：用 “” 为样品，点击「Start」自动光电倍增管电压，屏幕出现闪烁“PMTs Set Successfully”，便可点击 「Next」。在 Comp 窗口下：用 “” 为样品，点击「Start」可执行自动 FL1 - % FL2, FL2 - % FL1和 FL3 - % FL2。屏幕出现闪烁“Compensation Set Successfully”，便可点击「Next」。在 Sens 窗口下：用 “” 为样品，点击「Start」可自动检测各参数灵敏度。 在 Summary 窗口下：可得到所有检测。 完成后，移去标准微球管并插上蒸馏水试管。在Summary Report 状态下点击 Quit 键。或从 File menu 中选择 Quit，退出程序。 当打印对话框出现时，点击OK。将打印一份总结报告，请将报告归档备查光电倍增管可以有多种电压设置，而电压设置的不同将影响到它的探测灵敏度，增大电压也就意味着信号的放大和channel值的增高。 FACSComp首先根据FSC的强度设一个上限和一个下限来减小双联体（两个bead粘在一起）和碎片的影响，然后根据unlabeled-beads所对应的Target Value来调节SSC、FL1、FL2和FL3 PMT的电压，使它们的平均值在Target Value±2的范围内。由于FL4几乎探测不到Unlabeled beads的自发荧光，因此FL4 PMT的电压必须通过APC beads所对应