n 病毒毒力测试实验.docVIP

毒力测试技术路线 前言: 虫媒病毒（Arbovirus）是指由吸血昆虫传播的病毒，其特点是病毒可在昆虫体内繁殖，但昆虫本身不发病，昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜引起疾病，因此虫媒病毒可以引起人畜共患传染病（1）。套式病毒（Nidoviruses）包括了冠状病毒（Coronaviridae）和动脉炎病毒（Arteriviridae）及罗尼病毒（Roniviridae），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7bp）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒（2）。 国内，深圳市龙岗区疾控中心开展了虫媒监测项目，从医院监测点捕获的成蚊标本中首次发现昆虫套式病毒NDiV，并应用C6/36细胞成功地分离到NDiV病毒，是目前国内对NDiV的研究仅有这一篇报道（3）。 国外,2011年，mBio报道了首篇昆虫套式病毒的研究（4），在科特迪瓦的原始森林的库蚊中首次发现了昆虫套式病毒，命名为Cavally virus（CAVV）。同年，PlOS Pathogens刊登（5）同为昆虫套式病毒的研究，病毒于2002年在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离成功（6），在当地库蚊标本也分离得到，作者Phan Thi Nga根据病毒的分离地点将其命名为Nam Dinh Virus（NDiV）。由于NDiV和CAVV的宿主与分子特性相似，与套式病毒中的已有家族存在差异，故Phan Thi Nga将其归类为Nidoviruses的新家族，命名为Mesoniviridae（7）。传统意义的套式病毒（Nidoviruses）包括冠状病毒（Coronaviridae）、动脉炎病毒（Arteriviridae）及罗尼病毒（Roniviridae），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7kb）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒。在科特迪瓦与越南发现的昆虫套式病毒填补了套式病毒存在于节肢动物的空白。目前最长的单股正链ssRNA+节肢动物病毒，NDiV与CAVV核酸序列长度约为20.2kb，这显示它们可能是套式病毒中如猪生殖与呼吸综合征病毒的短基因病毒（small genomes）与SARS冠状病毒的长基因病毒（large genomes）之间的进化连接。目前，国外关于NDiV的研究报告仅有Phan Thi Nga发表的两篇论文（5,7），国内的研究报告有“中国国内首次发现 Nam Dinh 病毒” 。研究程度只涉及病毒的分子结构学领域。虽然该病毒曾在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离得到，但尚未有具体的病理因果证据证明该病毒的致病性。 NDiV是否为新的虫媒病毒仍然需要进行深入的研究与论证，后续研究将有助于我国新分离虫媒病毒的致病性的研究，对探讨病毒与人类疾病的关系，对新发病毒的危害作出更客观的评估。 NDiV毒力测试实验步骤： 1．1 NDiV 乳鼠脑病毒悬液制备与保存 1~2 日龄健康乳鼠（昆明品系），脑内接种NDiV C6/36 细胞病毒悬液 0.02mL/只，在有纱窗设备的动物房中饲养。逐日观察乳鼠是否发病（如出现散窝、抽搐、弓背等症状），于濒临死亡时无菌解剖取出鼠脑。加无血清的 DMEM 培养液在冰浴中研磨成浆，12,000rpm 离心 10min，冻存管分装，液氮冻存备用。 1.2 NDiV 病毒株的获取途径（8） 1.2.1 NDiV 病毒在细胞中传代 利用C6/36细胞，模拟自然界中NDiV病毒在宿主C6/36细胞中传代，同时在C6/36细胞中连续传代。用已定量的病毒采用高感染复数(MOI)＜0.01的病毒悬液分别接种C6/36，逐日观察细胞病变情况，当CPE达到最佳时，冰冻于-30℃冰箱中破裂细胞，然后放置37℃环境下解冻，低速离心，通过0.22μm的过滤器过滤，收集上清液感染下一代细胞，如此培养数代细胞病毒。余下的上清液标记编号置于-70冰箱冻存备用。 1.2.2 NDiV病毒滴度的测定（9） 根据传统的空斑形成试验测定方法，将上述收集的病毒悬液采用空斑法进行病毒滴度测定。首先在 12 孔培养板内常规制备 BHK21和C6/36单层细胞。在冰浴中，将每代细胞病毒上清液用细胞维持液作10倍稀释（10-1至10-8），接种各稀释度的病毒悬液，每个稀释度接种各2孔，每孔0.4mL，摇动12孔板，使布满细胞层。置于37℃吸附1.0 h，每隔15min摇动一次，使病毒充分吸附。吸出孔内液体，加 2%琼脂糖覆盖胶，每孔3.0 （1.5）mL，室温下待覆盖胶凝固，然后细胞面朝上，置37℃孵箱中培养 6-7 d。直接加入4%甲醛固定30min后，自来水冲洗，加入1