MTT实验测脱氢酶活性.docVIP

休止细胞制备和脱氢酶活性测定 生命基地 200800140109 栾一 2011/6/14 摘要： 本文采用MTT法测脱氢酶的活性。首先制备休止细胞，利用细胞内的脱氢酶来催化反应进行；然后选择不同的底物，研究它们在相同浓度下对应脱氢酶的效率，以此判断它们在TCA循环中的 相对位置。为了研究不同浓度的底物对脱氢酶活性的影响，我们可以稀释制成一系列的底物梯度，然后用相同菌悬液来反应，以此研究脱氢酶促反应的动力学方程。 关键词：脱氢酶 休止细胞制备 噻唑盐 背景： 随着免疫学、血液学和肿瘤学研究的不断深入和发展, 科研部门和临床医院检测各种细胞和细胞因子活性等方面的工作日益增多, 但是其检测方法多不尽人意。目前细胞和细胞因子活性检测多采用同位素法、台盼蓝法等。这些方法虽各具优点, 但都存在着一定的局限性, 如操作过程繁琐, 检测周期长, 需特定仪器设备, 易污染环境等。所以长期以来, 人们一直在不断探索新的更快速更准确的检测方法来满足工作的需要。自从年美国学者建立了比色法以来, 它以其快速、灵敏、简便、准确等优点受到人们的普遍重视。现已广泛应用于各个领域, 例如检测细胞对化学药物的敏感性, 刺激剂对免疫细胞的反应、酶活测定等。 酶催化活性测定方法有定性的，也有定量的，定性方法包括组织化学方法和度纸测定等。酶定量测定可以分为简单反应和偶联反应两种类型。简单反应是直接测定酶促反应前后底物或产物量的变化。如果酶催化是一个简单的反应，在底物大大过量情况下，酶催化的反应速度与酶量成正比。因此可以通过测定反应底物的减少或者产物的增加就能确定酶的催化活性。所以一般依靠产物的生成来确定酶的催化活性。偶联反应的方法是指，如果要测的催化反应 A B；产物B再与另一个化合物C反应，通过测定C的变化来确定B的量，由此确定酶的催化活性。 本文将以北京棒状杆菌为研究对象, 较为详细地研究其呼吸链中脱氢酶活性, 通过在不同底物相同浓度的吸光度的测定，来确定各底物在TCA循环中的相对位置，以及相同底物不同梯度浓度的吸光度测定，来大致确定底物浓度对酶催化活性的影响。 北京棒状杆菌 AS1, 299菌株是中国科学院微生物研究所认当时北京清河粉丝厂的淀粉废浆中分离的到的一株革兰氏阳性、无芽孢的谷氨酸生产菌。1972年坚定认为这个菌株与木下报道（1958）的谷氨酸棒状杆菌及Lee.W,H. 报道的百合棒状菌较相近，而且能由肌酵、糊精和木糖产酸，此外还有“细丝”，而木下和李等整理的这个菌株无这些特点，故AS1, 299是当时世界上的一个谷氨酸生产菌的新种。因它分离自北京，故定名为北京棒状杆菌AS1, 299。该菌是我国筛选的第一个谷氨酸生产菌，并于1965年应用于生产。 北京棒状杆菌细胞短杆至小棒状，有时微呈弯曲，两端钝圆，不分枝，长呈棒状膨大等多形态。细胞大小0.7-0.9*1.0-2.5 微米。不运动，不形成芽孢，好养和兼性厌氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，不抗酸。固体培养基上菌落圆形，白色，直径约1毫米；48小时后稍呈淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑且有光泽，边缘整齐，呈半透明状，无粘性，不产生色素。为谷氨酸生产的优良菌株。 休止细胞又称静息细胞，把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长。另外休止细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。 三羧酸循环 柠檬酸循环（tricarboxylicacidcycle）：也称为三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA），Krebs循环。是用于乙酰—CoA中的乙酰基氧化成CO2的酶促反应的循环系统，该循环的第一步是由乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。在三羧酸循环中，反应物葡萄糖或者脂肪酸会变成乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)。这种活化醋酸(一分子辅酶和一个乙酰基相连)，会在循环中分解生成最终产物二氧化碳并脱氢，质子将传递给辅酶--烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 和黄素腺嘌呤（FAD），使之成为NADH + H+和FADH2。 NADH + H+ 和 FADH2 会继续在呼吸链中被氧化成NAD+ 和FAD，并生成水。这种受调节的燃烧会生成ATP，提供能量。 真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是三羧酸循环的场所。它是呼吸作用过程中的一步