FermentasDNA电泳疑难问题解答指南.docVIP

Fermentas DNA电泳 疑难问题解答指南 默认分类 2010-08-10 11:49:14 阅读139 评论0 ??字号：大中小?订阅 1. 所有或某些DNA条带不可见或黯淡1.1. 分子量标准上样量不够。遵照或DNA ladders/markers质检分析报告的推荐上样用量(~0.1-0.2 μg/mm宽凝胶泳道)。1.2. 染色不充分或不均匀。凝胶电泳后，溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)或SYBR? Green I染色观察DNA。如果凝胶中的DNA无需回收克隆使用，可以在凝胶和电泳缓冲液中同时加入溴化乙啶，终浓度为0.5 μg/ml。碱性琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶浸入300 ml 0.5 M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中处理30分钟，然后再用0.5 μg/ml溴化乙啶溶液染色30分钟。变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳后，将凝胶浸入1X TBE缓冲液中15分钟除去尿素。然后再用1X TBE缓冲液配制的溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)染色15分钟。确保凝胶完全浸没在染色液中。1.3. DNA电泳跑出凝胶。溴酚蓝电泳至凝胶长度2/3(Orange G, 4/5)处时停止电泳。参考p.441表格了解示踪染料在不同凝胶中的迁移情况。电泳过程中，确保凝胶始终浸没在电泳缓冲液中。确保凝胶和电泳装置水平放置。1.4. 凝胶中DNA条带弥散。避免长时间电泳、过量染色和脱色过程，否则会导致凝胶中小分子DNA片段弥散。凝胶拍照前不能长时间保存，否则会引起DNA片段弥散和条带黯淡。1.5. DNA条带被电泳示踪染料掩盖。电泳前，与样本DNA和分子量标准混合的上样染料不能过量。选用Fermentas公司的DNA ladder/marker包装中配套的上样染料溶液，因为这些溶液包含平衡化用量的示踪染料。紫外光照射下，DNA条带不会被示踪染料掩盖。DNA ladders和样本电泳前处理方法请参考使用推荐。2. 弥散的DNA条带2.1. 核酸酶降解DNA。电泳缓冲液和凝胶需新鲜配制，选用无核酸酶的试管和枪头，避免核酸酶污染。2.2. 电泳条件不正确。参照p.442推荐方法制备凝胶，凝胶制备和电泳使用同一种电泳缓冲液。整个电泳过程中，确保凝胶始终浸没在电泳缓冲液中。电泳时，电压不能太高，电场强度建议为5-8 V/cm。为了使条带更窄，电泳刚开始时先用低电压电泳几分钟。高电压(最高达23 V/cm)快速电泳时，选用GeneRuler?或O’GeneRuler? Express DNA ladders(#SM1551/2/3或#SM1563)。整个电泳过程中，电压过低会导致条带弥散。电压过高会使凝胶过热和DNA变性。如需计算优化的电泳条件(电压)和使用推荐的V/cm值(多数情况下为5-8 V/cm，依分子量标准不同而异)，遵照以下计算方式： 测量正、负极之间的距离 – X, cm； X, cm值乘以推荐的电压(Y, V/cm)； X (cm) x Y (V/cm)的计算结果就是Z – 实际电泳的推荐电压。 2.3. 凝胶迁移效应。DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率，导致DNA停留在点样孔处或产生凝胶迁移。Lambda DNA或其它含长互补突出末端的DNA可能会退火结合，迁移带型不规范(见为排除上述影响因素，使用添加1% SDS的6X Loading Dye SDS溶液(#R1151)，防止DNA-蛋白相互作用和避免长粘性末端DNA退火结合。电泳前，65°C加热含有SDS的样本10分钟、冰浴、离心后上样。 DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率，导致DNA停留在点样孔处或产生凝胶迁移。Lambda DNA或其它含长互补突出末端的DNA可能会退火结合，迁移带型不规范。为排除上述影响因素，使用添加1% SDS的6X Loading Dye SDS溶液(#R1151)，防止DNA-蛋白相互作用和避免长粘性末端DNA退火结合。电泳前，65°C加热含有SDS的样本10分钟、冰浴、离心后上样。2.4. DNA上样量过大。遵照或DNA ladders/markers质检分析报告的推荐上样用量(~0.1-0.2 μg/mm宽凝胶泳道)。如果可能的话，建议各样本DNA的上样量相同。2.5. 样本的盐浓度过高。样本中盐浓度过高会产生弥散或漂移的带型。水或TE缓冲液重悬DNA除盐前，可用离心柱纯化或冷冻的75%乙醇沉淀和洗脱DNA。2.6. 点样孔质量差。梳子插入凝胶时，确保以垂直方式插入。凝胶浇注和固化过程中，梳子不能移动。3. 带型异常3.1. Lambda DNA marker上样前未加热。所