《2生物样品的预处理.pptVIP

江南大学医药学院 初级分离阶段Primary separation Primary separation的任务 分离细胞和培养液 破碎细胞释放产物 溶解包含体 复原蛋白质 浓缩产物 去除大部分杂质 生物样品的预处理 不同来源样品分离的预处理 植物组织提取物的制备 动物组织提取物的制备 细菌中重组蛋白的提取制备 细胞的破碎与分离 常见的方法 细胞破碎技术的发展方向 1 不同来源样品分离的预处理 样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织提取液等。 生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素等，因此对目标组分进行初步富集和分离，对干扰组分进行初步去除等工作都属于预处理。 生物样品特征： 目标产物浓度普遍较低，悬浮液大部分是“水”，组分复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物； 分离过程很容易发生失活现象，pH、离子强度、温度等变化常常造成产物的失活； 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。 分离过程注意点 迅速加工，缩短停留时间 控制好操作温度和pH 减少和避免与空气接触受污染的机会 总体设计好各组分的分离顺序 不同来源样品分离的预处理 1.1 植物组织中活性物质的提取 1.1.1 酶的提取 植物组织中所存在的酚类化合物使植物中提取酶的过程变得复杂。 植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应, 使目的酶失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。 酚类化合物与蛋白质的结合方式 可逆结合 酚类化合物的两个羟基与蛋白质分子形成氢键，例如肽键的CO端和NH端 不可逆结合 酚类化合物的两个相邻羟基被氧化为邻苯醌之后，通过共价键与蛋白质分子中的自由氨基以及巯基结合 引起蛋白质活性基团集合，引起聚集、交叉结合和沉淀（酶促褐变作用） 预处理需要注意： 温度尽可能低 提取液的量要保证“充分浸入” 加入足量酚类吸附剂 加入足量氧化酶抑制剂 搅拌转速要恰当 pH要控制在合适范围，一般5.5～7 酚类吸附剂的种类： 天然和合成的聚合物 清蛋白 尼龙粉 聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP） 通过-CO-N=与酚羟基形成氢键 聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP） 聚乙烯和聚丙烯树脂，如离子交换树脂XAD-2、-4和-7 聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（Bio-Rad AG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和阳离子交换树脂（Dowex-50） 表面疏水，易吸附带疏水基团的化合物 酚氧化酶抑制剂 抗氧化剂：2-巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE) ，抗坏血酸盐 前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除剂 抗坏血酸盐能阻止醌重新还原成酚， 在低浓度的醌存在下就很易被消耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用（50mmol/L） 1.1.2 RNA的提取 从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。 Northern杂交分析、纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库、RT-PCR及差示分析等过程中需要高质量的RNA 能否有效地去除多糖、酚类化合物、萜类化合物RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。 酚类化合物与RNA不可逆结合 导致RNA活性丧失、用苯酚或氯仿抽提时RNA丢失、形成不溶性复合物 多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀 萜类化合物和RNase会造成RNA的化学降解和酶解 酚类化合物的干扰及对策 还原剂法 2-巯基乙醇(ME) 、二硫苏糖醇（DTT）或Cys 来防止酚类物质被氧化，硼氢化钠（NaBH4）是可还原醌的还原剂 螯合剂法 PVP和PVPP中的-CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强 Tris-硼酸法 硼酸可与酚类靠氢键形成复合物，抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合 牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会 丙酮法 用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA 通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。 多糖的干扰及对策 植物组织往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，对RNA提取造成较大的干扰。 对策： SDS-盐酸胍处理； 高浓度Na+或K+离子下，苯酚、氯仿抽提； 低浓度乙醇沉淀多糖； 醋酸