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生物奥赛——生化实验 2010 实验内容 蛋白质含量测定 酱油中氨基酸含量测定 脲酶鉴定 蛋白质含量测定 实验原理 蛋白质含量测定有许多方法，考马斯亮蓝(G-250)比色测定是最灵敏的方法之一。考马斯亮蓝可与蛋白质通过氢键结合生成复合物，结合符合比尔定律。结合前颜料为棕红色，结合后为蓝色，最大吸收由465nm转变成595nm。通过测定595nm处最大光吸收的增加，可知结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个快速的过程，两分钟内即可完成，并可稳定1小时，测定范围在10～100ug/ml蛋白质之间为线性范围，去污剂有颜色干扰，可影响比色结果。 本试验是利用考马斯亮蓝与不同量蛋白质的标准曲线来目测未知蛋白质溶液的蛋白质含量，并计算未知溶液的蛋白质含量。 药品试剂：考马斯亮蓝；标准蛋白液 实验方法及步骤 1. 标准曲线 另取7支干试管，编号，分别吸取上述溶液1ml加入试管中，再向其中分别加入1ml蒸馏水，2ml考马斯亮蓝试剂，摇匀。 2. 未知样品蛋白质含量的测定 实验结果与分析 酱油中的氨基酸含量测定 实验原理： 本实验用聚酰胺薄层层析，在乙酸溶液中展层，再用茚三酮显色，以标准谷氨酸为对照，观察不同酱油中的氨基酸的含量变化，在一定程度上它反应了酱油的质量。样品在乙酸溶液中展层,由于不同分子极性不同,分配层析速度和位置不同而分开。展层后，谷氨酸的位置靠近前沿。可看到不同品质酱油中谷氨酸含量不同。 药品试剂：展层剂；茚三铜溶液；标准谷氨酸溶液 实验步骤 1. 点样：重复点样（毛细管） 2. 展层（静止展层） 3. 显色：将茚三酮溶液喷至薄膜上（或将少量茚三酮溶液倒入小培养皿中，展层后的薄膜速浸速取），再用热风吹干。 实验结果 问题 1．在生物化学中各种层析基于哪三种原理 2．亲和层析在原理上应属于哪一类层析? 3. 用于蛋白质凝胶电泳后,多用考马斯兰染色,在用有机溶剂脱色后,有色的有机溶剂溶液若从新用于脱色,需将染料从有机溶剂中去除,用下述什么柱过滤可将染料吸附? 4.在薄层析中表明某物质从起始点(原点)移动到达的位置有一个测定值叫比移值(Rf值—rate of flow ).Rf值定义及其影响因素？（溶剂的性质，溶剂的组分，介质的性质，介质的厚度，层析室溶剂的饱和度，样品中杂质的多少，展层的距离，上样量，温度，展层剂pH值 ） 脲酶测定 实验原理 有些生物化学反应中指示反应完成，经常使用直观的指示剂指示，如氧化还原指示剂和酸碱指示剂。氧化还原指示剂是氧化状态下和还原状态下各有不同颜色；酸碱指示剂是指示生物化学反应前后溶液的酸碱度变化，不同酸碱度各有不同颜色。 这里进行一次酶促反应试验，人的血液中和尿液中都含有尿素，尿素的含量变化是许多病变的重要指标。尿酶可作用于尿素，它的反应如下： (NH2)2C=O + H2O 2NH3 + CO2 实验中分别加入三种指示剂A、B、C，但只知道三种是中性红、百里香酚兰和亚甲兰，其中有酸碱指示剂和氧化还原指示剂，不知道瓶子编号所对应的试剂。 试剂材料： 30%乙醇溶液，2%尿素溶液，指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝） 大豆粉，玉米粉 实验步骤 1、提取脲酶悬液。 2、将三角玻璃漏斗放在另一组（2个）清洁的三角瓶上，再将少许脱脂棉轻压放到漏斗内，分别将上述提取悬液倒入三角玻璃漏斗中用脱脂棉过滤。弃沉淀，回收滤液，滤液即脲酶提取液。滤液不一定清澈透明，不影响测定。 3、取2组试管每组7支,标号，依下表加入各种试剂。在试剂加入后混匀，静置10分钟观察颜色变化，并将颜色变化写入下表。 实验结果 问题 1、脲酶对尿素的作用是否是氧化还原反应？ 2、三种指示剂中哪种是酸碱指示剂？ 3、在生化反应中反应前后有酸碱变化时，酸碱指示剂有无电子的得失？ 4、在光合作用的希尔反应中，照光的叶绿体可使2，6一二氯酚靛酚退色，这一氧化还原指示剂在退色后是被氧化，还是被还原？ 注：希尔反应（Hill reaction）是指在光照条件下，绿色植物的叶绿体裂解水，释放氧气并还原电子受体的反应。2，6一二氯酚靛酚是一种蓝色染料，接受电子和H+离子后被还原成为无色。 5、在生化反应的指示中，氧化还原指示剂是否参与这一生化反应？ 6、过滤时为什么用脱脂棉而不用滤纸？ * * * * 1号为空白，2-7号为标准蛋白液，8号为样品 蛋白质含量测定有几种方法？ 凯氏定氮法，双缩脲法，紫外吸收法，Folin-酚试剂法（Lowry法），考马斯亮蓝法，BCA法。 1号为谷氨酸钠标准溶液，2-7号为酱油样品。照片中出现蓝紫色斑点处即为谷氨酸聚集处。 脲酶 图1 脲酶与尿素反应指示剂变化图像（上排加大豆提取液，下排加玉米提取液） 指示剂A是中性红，指