免疫组化基本技术(二)免疫组化基本技术(二).pptVIP

3.制备细胞玻片应注意 （1）易脱片； （2）细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106； （3）富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。 4.活细胞标本的制备法 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。 五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、 增加组织硬度、便于制片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。 2.固定液的种类 (1)甲醛固定液  10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林 (2)4％多聚甲醛固定液(3)Bouin S液及改良Bouin S液(4)Zenker S液 重铬酸钾 25mg 氯化汞 10g  冰醋酸 50ml 蒸馏水 800ml (5)Zamboni S液 多聚甲醛 20g 饱和苦味酸 150ml PB液至 1000ml(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。(8)Kanovsky S液(9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PFG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇 类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。 3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定 (3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。(4)组织固定后必须彻底冲洗。 六、组织脱水、浸蜡及包埋 1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。 2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。 常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。 3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油 4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。 在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。 5.常规石蜡包埋过程(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ (3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ(4)石蜡包埋：修蜡块，标号 * 免疫组化基本技术（二） 体液沉渣细胞学切片制作： 取两只10ml试管，分别装入体液10ml，离心后留取沉渣。 滴入蛋清1～2滴混匀，加入固定液5ml，固定1h，离心后留取沉渣。 将试管剪开，底部1cm处，取出沉渣，用擦镜纸包好，进行常规脱水、包埋、石蜡切片。 该方法可以免除大范围的阅片,又可避免漏诊, 可重复切片, 使IHC标记更为方便。 自动细胞离心涂片机制作胸腹水细胞学涂片方法。 影响固定