质粒种类与应用精编.ppt

克隆载体 λ噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分 ?①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 ②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组文库。???????? 表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因 Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成，成熟的基因 Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的 α 螺旋蛋白。顶端由 5 个基因 Ⅶ 和 5 个基因 Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因 Ⅲ 蛋白和 5 个基因 Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。右图是 M13 噬菌体结构模型。 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。 粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。 cos 序列是 ??噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。 粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。 人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体有多克隆位点、 α-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。 典型的这类质粒有 pBluescriptⅡKS（±），这类质粒一般由 4 个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端 KpnⅠ 和 SacⅠ 的顺序，用 KS 或 SK 表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA ，用 + 或 - 表示）。 pBluescriptⅡKS（±） 的多克隆位点与 pUC18/19 的不同，且使用 f1 噬菌体的复制与包装信号序列 。????????????? F 质粒 大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。 虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。 携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。 每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 真核生物载体 电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。 该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。 显微注射技术将外源DNA注入细胞 基因枪技术 是一种将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。 PDS-1000/H台式基因枪可以实现对细胞的原位转导；应用于包括培养细胞、组织、器官、