2 原核细胞表达载体和真核细胞表达载体有何区别.DOCVIP

上海交通大学医学院教案 教 案 课程名称___分子生物学____________ 授课题目 重组体在宿主细胞中表达与调控 授课日期 2008 年 12 月2、3日 授课班级 06级检验本科 授课时数 6学时 授课方式 理论课 授 课 重 点 、 难 点 基因表达的概念、基本条件 原核生物基因表达的特点 原核细胞表达载体 重组体在真核细胞中表达的策略 真核细胞表达元件 哺乳动物细胞表达载体 哺乳动物基因转移的遗传选择性标记 基因表达产物的分离与纯化 基因表达产物的检测 授 课 内 容 、 教 具 与 时 间 分 配 教具：多媒体Powerpoint 时间分配: 前3小时讲授第一、二节，后3小时第三、四节 内容： 第一节 基因表达概述 基因表达的概念 基因表达是指基因携带的遗传信息，经过极其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质过程，即DNA--RNA--蛋白质。 基因表达的基本条件 基因表达的整个过程主要涉及到DNA经转录(transcription)合成信使RNA(messenger RNA，mRNA)，再以mRNA为模板翻译(translation)成蛋白质。DNA所含的遗传信息决定丁物种的遗传和变异，蛋白质表现了遗传性状，而mRNA储存和传递遗传信息，并在遗传信息的表达过程中起重要的作用。 基因表达的调节包括以下几个水平：①转录水平的控制；②转录产物的加工调节；③ mRNA从细胞核向细胞质运输过程中的调节；④mRNA降解的调节；⑤翻译水平的调节。其中以转录的调控最为关键 第二节 重组体在原核细胞中的表达 原核生物基因表达的特点 重组体在原核细胞中的表达是使克隆的外源基因在原核细胞中快速、高效地合成基因产物，这是迄今为止了解得比较深入和实际应用最为广泛的表达系统。 原核生物只有1种RNA酶，用来识别原核细胞的启动子(promoter)，催化所有RNA的合成。原核生物的基因表达是以操纵子(operon)为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是基因表达的协同单位。调控区主要分为3个部分：操纵基因(operator)、启动基因或称启动子(promoter)及其他有调控功能的部位。因此在构建原核表达载体时，必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列。原核基因一般不含内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统，因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中的内含子部分不能被切除。所以外源基因必须用cDNA或化学合成的基因，不能用基因组DNA。原核生物无核膜，所以转录与翻译是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合，并翻译形成蛋白质。 二. 外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件 (一)启动子 乳糖启动子(Lac) 色氨酸启动子(Trp) Tac启动子 PL和PR启动子 (二)核糖体结合位点 大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点是SD序列。 (三)终止子(terminater) 一个基因的3，末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能，这一DNA序列被称为转录终止子。 原核细胞表达载体简介 基因工程的载体有克隆载体和表达载体之分，克隆载体适用于外源基因在受体细胞中复制扩增，表达载体适用于在受体细胞中表达外源基因。组建表达载体比较困难，它需要有一个强启动子及其两侧的调控序列，在克隆基因和启动子之间要有正确的阅读框架，不引起读框移位(frameskiR)。对于原核系统还必须注意SD序列和起始密码子ATG之间要有合适的距离。这类载体不仅能保证克隆所需要的结构要求及重组DNA分子的转移和复制，而且可使该重组DNA分子被翻译成蛋白质。因此，构建原核表达载体时，必须考虑多个因素，如选择最优的调控程序、强启动子和合适的核糖体结合位点，质粒的稳定性，被翻译出的蛋白质的性质和稳定性，选择合适的宿主细胞等。 1．非融合型表达载体pKK223-3 2．分泌型表达载体PIN III系统 3．融合蛋白表达载体PGEX系统 四、对外源目的基因的要求 为了获得符合要求的目的基因，常用的方法如下： 1．反转录制备cDNA 2. 人工合成基因 3. PGR扩增目的基因 重组体在真核细胞中表达的策略 哺乳动物细胞表达的优点及载体种类 哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，经过筛选可得到转化的细胞，而这种转化细胞又可将表达的蛋白质产物分泌到培养基中，从而更有利于生物制品的制备；利用这种转化的真核细胞还可进行转基因的细胞移植(如可将表达目的基因的