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测序质量判断和测序常见问题 DNA测序原理 目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。 Sanger 法测序的原理 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 自动化测序 首先，通过对ddNTP进行不同的荧光标记实现在一个泳道实现四种碱基判读。 后来，各公司有改进了电泳方法，将毛细管电泳技术引入了测序仪，大大提高了分辨率。（排除了横向扩散和泳道间的干扰） 影响测序结果的因素 常见问题 反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上 序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插入”，有“缺失” 测序长度太短了 常见问题的原因 反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上 根本没反应，引物和模版不匹配 序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插入”，有“缺失”，测序长度太短了 有反应，但质量差 分析一下原因可帮助大家却认测序结果，确定是否需要重新测序。 分析时应从大到小，从整体入手 软件 Sequence Scanner v1.0 完了！ * 荧光激发和接受的灵敏度 检测 电泳条件 上样量 电泳分离 样品纯度（空气，盐离子，染料，乙醇） 产物纯化 退火时间 退火温度 体积 反应条件 污染组分 其他标准试剂 引物 模版 反应组分 测序反应 哥们给你上了板水 引物和模版不匹配 反应信号相当弱 多结合位点 多模版 有反应信号 无 引物引发效率 模版量 弱 气泡 反应过程中突然有高峰位置不定 突变 个别碱基不匹配前后反应信号良好 引物二聚体 50bp之前信号杂乱，有高峰 乙醇峰 200,400有G峰 染料峰 70-80，100-120有C或T峰 个别位置问题 互补结构 Poly结构 信号突然衰减或消失 引物过多 反应前部较好但很短，看峰形是个“大头娃娃” 头大脚小 样品降解 向后拖 引物降解 向前拖 峰宽，峰形 平均 强 有 原因 具体位置 整体形状 反应 整体比对 *