孚尔根(FEULGEN)染色.ppt

1202班二组 成员： 韩恺 陈辰 丛林 刘丹 刘丹然 姚璐璐 主讲人：韩恺 孚尔根（FEULGEN） 染色法 1924年孚尔根首先用Schiff试剂作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。 自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示脱氧核糖核酸的方法,是DNA的一个特异性检查法该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果并不使人满意. 反应原理 样品经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 孚尔根染色法的反应原理主要与Schiff试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。 碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色 利用1M HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。 1.?Carnoy固定液：?3份95%酒精加入一份冰醋酸。 ?2.1mol/L?HCl：取比重1.18的浓HCl82.5ml，加水100ml。? 3.?Schiff?试剂 4.?亚硫酸水溶液（漂白液）?10%偏重偏亚硫酸钠水溶液5ml，蒸馏水100?ml，1mol/L?HCl?5ml，摇匀，塞紧瓶塞。此溶液在使用前配制，否则会因SO2逸出而失效。 实验试剂 Schiff 试剂的配置 称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮?5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml?1N?HCl，冷却至25℃时，加入0.5g?Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用 操作方法及步骤 以Feulgen染色法观察洋葱根尖有丝分裂为例 1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N?HCl中，加热到60℃水解8～10?min。 ?2．蒸馏水水洗。? 3．Schiff试剂遮光染色30min。? 4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。 ?5．水洗5min。? 6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 ?7．显微镜检查。?结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。 实验现象 注意事项 1.?对照切片的制做：进行Feulgen反应时,?一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1?h?(0.5?h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。 2、?固定剂的选择：实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂等，??但在上述固定剂中，?Carnoy效果较好，价格廉价，制作都比较方便，因此，本实验采用carnoy试剂。 3.?水解时间：Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,?反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。 4.?Schiff试剂的作用：Feulgen反应成功与否的一个