基因组DNA 文库的构建.ppt

基因组DNA 文库的构建 制作：### 主讲： ### 基因组DNA文库与cDNA文库 cDNA文库： 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。 cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 基因组DNA文库与cDNA文库 基因组DNA文库： 指将某生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 其实质就是采用“化整为零”策略，将庞大的基因分解成一段段，每段包含一个或几个基因。 为什么要构建基因组DNA文库 对于高等真核生物，基因数量庞大且复杂，单个目的基因所占比例极其微小，难以直接分离。 为增加成功分离的可能性，需要将这个基因进行扩增，但由于分离的是未知基因，故无法进行特异性扩增，只能构建该生物材料的基因文库。 构建基因组DNA文库的作用 分离有用的目的基因： 分离特点的基因片段； 分析特点基因结构； 研究基因表达调控。 保存生物的全部基因： 全基因组物理图谱的构建； 全基因组序列测定。 基因组DNA文库的特点 代表性 文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。 随机性 采用机械切割或酶切法随机断裂DNA，保证克隆的随机性。 增加文库重组克隆的数目，提高覆盖基因组的倍数。 Clark 和 Carbon 于1975年提出如下公式： N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数。 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的概率。 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小的比值。 ln(1-p) ln(1-f) N= ———————— 该公式用于预测一个完整基因组文库应该包含的克隆数目。 制作基因组DNA文库的常用载体 λ噬菌体：最常用到的载体。 广泛用于细菌、真菌等基因组较小的物种研究。 柯斯质粒： 稳定性较差，大量复制易缺失。 细菌人工染色体（BAC）： P1源人工染色体（PAC）： 酵母人工染色体（YAC）： 可以插入大片段DNA，主要用于基因组做图等。 ①工具的准备； ②载体的制备； ③HMW DNA的提取 ； ④HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ⑤载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑥重组克隆的挑选和保存； 注1：高纯度大分子量基因组DNA (High molecular weight DNA, HMW DNA)。 注2：构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。 注3：以下，以 λ噬菌体为例简述DNA文库的制作过程（P184）。 ①工具准备 λ噬菌体载体； 限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ； 琼脂糖凝胶（或蔗糖）； T4连接酶； 注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。 ②载体的制备 cos L R cos BamH Ⅰ位点 载体DNA cos L R cos B B 可用载体DNA片段 弃去中间片段 ③HMW DNA的提取④脉冲电泳分级分离 真核基因组DNA （约3×109bp） Sau3 A做局部消化 被限制酶切开的DNA片段 S S 琼脂糖凝胶电泳 纯化约20kb片段 *