流式细胞仪分选仪工作原理.pptx

流式细胞分选仪工作原理陈邦chen@B内 容流式的概念流式的分析原理流式数据解读影响流式检测的因素流式分选工作原理流式的概念细胞术检测经典方法--荧光显微镜/激光共聚焦优点：样本兼容性强，定性分析缺点：分析速度慢，参数少，难以定量流式细胞仪概念图流式细胞仪通过检测器接收激光照射液流内细胞(或颗粒)产生的光信号，经过光电转换和统计分析，从而反映细胞物理化学特征和细胞功能。流式细胞术的特点单细胞分析分析速度快多参数标记结果客观流式的检测对象细胞细菌微藻染色体单个的生物颗粒、可溶性细胞因子等流式细胞仪的检测内容细胞结构细胞大小细胞内粒度度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体流式分析原理流式细胞仪构造液流系统承载细胞快速流动形成单细胞流流体动力聚焦光学系统激光：信号激发滤光片：光信号传递检测器：信号接收光信号检测 前向散射光(FS) 侧向散射光(SS)散射光信号 自发荧光 转 染 荧光标记荧光信号散射光信号散射光信号由细胞（颗粒）本身及其内容物对激光的折射产生，主要反映了细胞（颗粒）的物理特征如大小或内部复杂程度。散射光信号前向散射光(FS)侧向散射光(SS)反映细胞大小反映细胞内部复杂程度LaserFS Sensor前向散射光 前向散射光（FS）信号的反映细胞的大小LaserSS Sensor侧向散射光侧向散射光（SS）信号的反映细胞的颗粒度RBCs, Debris,Dead CellsFS/SS 散点图GranulocytesLymphocytesMonocytes可以根据细胞的大小和颗粒度这两个基本特征，对细胞进行初步的分群和分类。Fluorescence detector( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5……)荧光信号Laser细胞自身萤光或使用荧光染料、荧光抗体标记，对细胞的生物/化学指标进行检测细胞受体/分子 核酸 (DNA/RNA)蛋白酶 染 色体基因表达 离子浓度让目标特异性带上荧光1) 抗原抗体结合（如表型测定，比如CD3-FITC）2) 荧光素特异性结合（如周期测定，比如PI测定细胞周期）3) 生物大分子之间的结合，如 PS 与ANNEXIN V的结合（凋亡测定）4）通过相互作用引入荧光（FRET）5）通过代谢不同对目标进行识别（SP染色）6）通过电势能结合（膜电位测定）荧光染料EX EM应用 荧光染料EX EM应用 激光器和荧光检测器的数目越多，选择越广激光功率越大，激发效果越好。荧光素选择电子系统光电转换数据处理光电转换Area/Lin面积High/Peak 峰高Width峰宽Log (对数)Lin (线性)流式分析流程细胞荧光素/抗体流式数据解读流式图的解读单参数-直方图：X轴表示荧光强度Y轴表示频数双参数-散点图：X轴与Y轴均表示荧光强度一个点表示一个细胞提供信息：流式的结果图例（单参数）直方图（双参数）散点图百分比 —— 目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对数 —— 目标细胞的浓度荧光强度—— 单个目标细胞上表达某种荧光素的多少细胞相对大小……影响流式检测的因素样本制备单细胞悬液的制备：物理法、酶解法标本完整性（有无严重溶血或凝血）抗凝剂选择：EDTA（12-24h）、肝素(48-72h)样本洗涤(wash or no-wash)样本浓度细胞活率染色步骤（胞外 → 胞内）影响流式结果的参数设置阈值/触发信号（Threshold/Triger）电压（Voltage）/ 增益（Gain）荧光干扰（补偿 Compensate）圈门设门（Gate）统计（Statistics）阈值/触发信号（Threshold / Triger）数据采集的前提条件所选择的信号被称为阈值或触发信号阈值可以量化，大于该阈值的细胞信号才会被收集，以排除不必要杂质的干扰电压增益目的：调节检测器的信号扩增程度，信号随着电压或增益的增加而增强。作用：通过电压及增益的调节区分信号强弱不同的细胞。电压增益增加，信号变强；反之，信号变弱。※ 电压调节阴性对照（同型对照，空白对照）：以阴性群完全出现，以正态分布为标准，调节电压使阴性对照的本底荧光处于比较低的水平。荧光干扰（补偿 Compensate）当细胞携带两种或两种以上的荧光素时，受到激光激发会发射出两种或以上波长的荧光。由于目前所使用的荧光染料发射谱较宽，虽然他们之间各自发射峰值各不相同，弹发射谱范围有一定的重叠，会对其他通道上的数值产生影响。补偿矩阵Untouchable =其他染料没有干扰(clean row)U N T O