生化3第三章核酸化学.pptVIP

 （三）小片段核苷酸的顺序测定 1、按序降解法 第六节核酸研究的常用技术 一.DNA的凝胶电泳 （一）琼脂糖凝胶电泳 1.琼脂糖凝胶浓度及选择 2.琼脂糖凝胶电泳的分辨率 3.琼脂糖凝胶电泳的用途(分离,测量,回收,印迹) （二）PAGE电泳 1. PAGE浓度及选择 2. PAGE电泳的分辨率 3.PAGE电泳的用途 （三）影响凝胶电泳Rf值的因素 1.分子大小 2.分子构象 3.凝胶浓度 4.电流电压 5.温度 第三节 DNA的分子结构 一、DNA的一级结构及测定 1.加减法 2.双脱氧法 3.化学修饰法 二.DNA的二级结构 2.0 nm 小沟 大沟 双螺旋DNA的结构参数 32.7o 36o 38o -60o 0.255 0.34 0.33 0.27 11 10 9.3 12 2.8 3.4 3.1 4.5 2.0 2.3 1.92 1.8 右75%Na+ 右92%Na + 右66%Li + 左 人工合成 A－DNA B－DNA C- DNA z－DNA 碱基旋转角度 碱基对间垂直距离（nm） 每转碱基对数目 螺距（nm） 螺旋直径（nm） 旋转方向 结晶状态 类型 H-DNA 三、DNA的三级结构 DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负超螺旋 原核 双链环状DNA（dcDNA） 病毒 单链环状DNA（scDNA） 单链线性DNA（ssDNA） 第四节 核酸及核苷酸的性质 一、溶解性 DNA在PH4.2时溶解度最低。 RNA在PH2-2.5时溶解度最低。 1.水溶性 微 溶于水，不溶于有机溶剂,水中溶解度DNA达2%，RNA达4% 2.盐溶性 DNA-蛋白，溶于1mol/L Nacl ，低盐不溶。 RNA-蛋白，溶于0.14mol/L Nacl ，高盐不溶。 3.不同PH的溶解性 二.两性性质 1.腺嘌呤 2.鸟嘌呤: 4.尿嘧啶 胸腺嘧啶 3.胞嘧啶 核苷酸两性离解及等电点 三、核酸的紫外吸收特性 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光 四、核酸的变性与复性 （一）. 变性 变性:稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征: 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素: pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛），低离子强度 加热 热变性和Tm : DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85?C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44 （二）. 核酸的复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 纯度/溶液离子强度 第五节 核酸及其组分的分离纯化与测定 一.分离纯化的一般原则 1.防止核酸酶降解 2.防止化学因素降解 3.防止物理因素降解 二.DNA的分离纯化 三.RNA的分离纯化 四.核酸组分的分离纯化 破细胞（1mol/LNACL） 离心去沉淀（含RNA-Pr） 上清（含DNA-Pr） SDS法/酚法（去蛋白） 离心去沉淀（变性蛋白） 上清（含DNA） 乙醇沉淀 离心收集沉淀（DNA） 细胞（饱和酚处理） 离心去沉淀（含DNA-Pr） 上清液调节PI（RNA PI） 离心去上清 收集沉淀（总RNA） 不同的RNA分离时可用： DEAE-Sephadex 超离心 Olig-dt 亲和层析 1.离子交换法： 四种核苷酸之间的分离采用离子交换法 阳离子交换剂洗脱次序： 理论次序