4酶竞争性抑制2010(阅读).pptVIP

实验四 酶的竞争性抑制 问题1：本次实验提取的是什么酶？ 问题2：该酶位于细胞的什么部位？催化 什么化学反应？ 琥珀酸脱氢生成延胡索酸: 问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？ 问题4：何为竞争性抑制？ 问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何 选择该物质作为抑制剂？ 问题6：如何设计实验方案检测酶被抑制的 程度？ 离心技术 利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体（离心机）中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。 离心机转子从静止状态加速旋转 如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降； 如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。 在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、浮力FB和摩擦阻力Ff。 离心力 转速（revolutions per minute，rpm） 相对离心力（relative centrifugal force, RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数， ×g RCF＝1.118×10-5RN2 R为离心转子的半径（cm），N为转速（转/分） 低速离心常以rpm表示 超速离心以×g表示。 离心机的分类 目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多，按其离心转子所能达到的最高转速分为： 低速离心机(在6,000rpm以下) 高速离心机(在25,000rpm以下) 超速离心机(在30,000rpm以上) 目前商售大型超速离心机最高转速达100,000rpm，相对离心力达803,000×g。 离心机转子 常用的离心机转子有三种： (1)固定角度转子(fixed-angle rotor)； (2)水平转子(swing-out rotor或swing-backet rotor)； (3)垂直转子(vertical rotor)。 转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。 钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，比较笨重，但它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。 离心的注意事项 1. 重量相等 离心管或试管需平衡（称重） 2. 位置对称 平衡好的离心管或试管需对称放置 实验目的 学习动物的处死方法 学习动物组织匀浆法 学习离心机的使用方法 了解琥珀酸脱氢酶的作用，进一步理解酶的竞争性抑制原理 酶竞争性抑制实验所需试剂 1、pH7.4磷酸缓冲液 2、0.25％琥珀酸钠溶液 3、0.5％草酸钠溶液 4、0.01％甲烯兰溶液 颈椎脱臼处死法 将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。 操作时用左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离，实验动物立即死亡。 实验步骤 1、肝糜液的制备： 取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏全部取出，置于研钵中，用生理盐水洗净肝脏中血液。 用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。 （分几次加入，每次加入后均需充分研磨。） 注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜上）。 研至匀浆后倒入试管中，离心5分钟(3000转/分)。 将上清液倒入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。 讨论 分析实验结果，说明酶竞争性抑制的特点。 思考题 临床意义： 说明酶竞争性抑制在临床中的应用。 下周实验 实验六 血清碱性磷酸酶(ALP)活性测定（p49~56） 书写预习报告 第一、二、三组分别制作ppt并发言 组长安排本次做清洁的同学 * * 三峡大学医学院生物化学教研室 琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2 延胡索酸 (fumarate) 琥珀酸 (succinate) 在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。 在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。 蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。 竞争性抑制：分子结构与底物相似的抑制剂与底物竞争结合酶的活性中心，抑制酶活性。 Ki：EI的解离常数，抑制常数 EI不能转变成产物 草酸、丙二酸与琥珀酸分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。 COO COO Oxalate 酶被抑制的程度取决于抑制剂与底物浓度之比。 可依据蓝色消褪的时间判断酶活性被抑制的程度。 The effect of a competitive inhibitor can be overcome with high concentration