4第四章基因克隆.pptVIP

原位杂交筛选 纤维素膜 转膜 杂交 文库克隆 挑克隆 纤维素膜 转膜 免疫检测 免疫检测挑选 挑克隆 文库克隆 2.利用基因组信息进行基因克隆 （1）信息分析 （2）PCR扩增方法克隆。 * * 第四章 基 因 克 隆 基因工程就是利用基因，进行重组，导入新的宿主细胞进行表达。那么，基因工程的基础是获得基因，没有基因，基因工程就无从谈起。所以，克隆基因是基因工程最基本的，也是最重要的技术。 这里所介绍的克隆仅仅是获得基因全长序列。有时只是指的编码序列。当然有时将克隆过程与表达体系构建过程结合起来一并进行。 一、已知基因的克隆 当我们已知到某一个基因的序列已经公布，希望获得这个基因的DNA时，就采用下面的技术路线进行克隆。 获得基因序列——PCR——重组——筛选 如何获得基因序列数据？ 进入Hppp://； 点击Entrez 点击：nucleotide 输入有哪些信誉好的足球投注网站关键词 选择合适的基因条目 PCR扩增时，如果序列在3Kb以下，可直接PCR扩增全长，如果序列长于3Kb，就需要分几段，分别扩增以后，用酶切的方法连接起来。或用PCR的方法连接。 重组：可直接利用PCR产物直接克隆到T-vector上，也可以用酶切连接。酶切连接必须在两端加上接头。 筛选：筛选到有插入子的序列就成功了。筛选出需要的序列后要进行序列分析，最终确定是所需要的基因序列。 重组克隆筛选 二、未知基因的克隆 1.已知部分序列，克隆全长基因 （1）构建基因文库，从文库中筛选基因序列： 两种不同的文库（基因组文库，cDNA文库） cDNA文库与基因组文库的区别： （1）材料不同：cDNA文库是以mRNA为材料构建的，基因组文库是以基因组DNA为材料构建的基因文库 （2）基因的结构不同：cDNA文库的基因无内含子，但有PolyA的尾巴，基因组文库的基因有内含子，有间隔序列 （3）内容不同：cDNA文库的基因有组织和发育时期的差异；基因组文库的基因对于同一生物而言，无组织和发育时期的差异 （4）目的不同，cDNA文库用于克隆表达序列，而基因组文库用于克隆全基因序列。 两种文库的应用： 基因组文库：用基因组DNA构建，目的是获得染色体DNA序列。克隆调控序列，分编码序列时需要； cDNA文库：用没mRNA逆转录成cDNA后构建而成。用于克隆cDNA,cDNA序列没有内含子，没有调控区序列，用于获得基因的编码序列。 文库构建方法 基因组文库： 核DNA—— 酶切——重组——转化——扩增——保存 cDNA文库： mRNA——逆转录——重组——转化——扩增——保存 筛选方法： PCR扩增 原位杂交 免疫组化 1,2,8为备选克隆 PCR筛选 *