第11-13章_核酸通论学案.ppt

（五） 核酸的化学合成（p260，自学） 固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMTr保护，3′-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和-OCH3两个基团， 3′-OH因此被活化。 每延伸一个核苷酸需四步化学反应： (1) 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5′-OH 。 (2) 缩合：新生成的5′-OH 在四唑催化下与下一个核苷3′-磷酰亚胺单体缩合使链增长。 (3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。 (4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸。 * * * * * * * * * * * * * * (三) 其他RNA的高级结构 第十五章 核酸的物理化学性质和研究方法 一、核酸的水解 (一) 酸水解 糖苷键比磷酸酯键更易水解，特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解。 (二) 碱水解 通常用于RNA水解，DNA的碱水解比较困难。 (三) 酶水解 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断, 又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。 DNA与限制性内切酶 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4~ 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内发挥的是防御外来DNA入侵的作用。 碱基 adenine 4.15, 9.8 cytosine 4.5, 12.2 guanine 3.2, 9.6 thymine 9.9, 13 核苷 adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8 cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13 guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5 uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13 核苷酸 AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4 ADP 3.9, 6.3 : --------- CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6 GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7 UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0 二、核酸的酸碱性质 碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式。 碱基中的H原子一般不移动，因此很少有亚氨基团。 在中性pH条件下，参与氢键的-NH2基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。 碱基、核苷、核苷酸的pK值 三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DNA 37 ?g RNA 40 ?g DNA分子的变性 四、核酸的变性，复性及杂交 变性和复性的含义 DNA的变性在紫外吸收上的变化 Tm的定义 影响Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G+C)%， 或GC%=（Tm-69.3）×2.44 3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大。 4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。 SSC溶液，常用于DNA的溶解。 (二) 复性 T1/2 × C ＝ const DNA浓度与复性时间的关系 影响复性速度的因素 1.DNA的片段越大,复性的速度越慢; 2.DNA的浓度越高,复性的速度越快; 3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快; 4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低; 5