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第二章 基因工程及其在食品工业中应用 第一节 概述 基因工程(Genetic engineering)，又称分子克隆(Molecular cloning)或重组DNA技术(Recombinant DNA Technology)，其涵义为：用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子转入受体细胞，使异源基因在其中复制表达，从而改造生物特性，大量生产出人类所需要的产物的高新技术。 第二节 工具酶 限制性核酸内切酶的命名 (1)根据酶相应来源的微生物的学名，取其属名的第一个大写字母和种名的头两个字母(小写)组成酶的基本名称(斜体)； (2)若微生物有不同的株系，取其株系的第一个字母加于酶名称之中； (3)用大写的罗马数字来区分存在于同种微生物中具有不同酶切活性的内切酶。 例如：从流感嗜血杆菌d株中先后分离到3种限制性内切酶，分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。 酶的来源：Haemophilus influenzae d （属名） （种名） （菌株） 限制性核酸内切酶种类 已经发现的限制性核酸内切酶有三类 Ⅰ类：由3种不同亚级构成，兼具修饰酶活性和依赖于ATP的限制形内切酶活性，结合于特定的DNA序列位点，随机切断识别位点以外的DNA序列。 Ⅱ类：与Ⅰ类酶相似，是多亚级蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。 Ⅲ类：只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。 三、DNA聚合酶Ⅰ 催化聚合脱氧核苷酸，使之逐个接到引物上去，最后形成新的DNA。 主要用来作DNA探针的体外标记，即缺口翻译；也用于酶法测定DNA序列。 四、碱性磷酸酯酶 催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5’-磷酸残基，即脱磷酸作用。可以防止载体DNA自我环化，从而提高重组效率。 五、T4多聚核苷酸激酶 催化ATP上的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’-OH上，主要作为DNA的5’-末端标记，标记待测的DNA片段。 六、S1核酸酶 从具有单链末端的双链DNA分子中除去单链生成钝端，以及打开双链cDNA合成中生产的发夹结构。 七、反向转录酶 用于催化合成与某种已知RNA互补的DNA链，以获得目的基因，在基因克隆中也是一种不可缺少的工具。 第三节 目的基因的制备 目的基因的制备方法 一、生物学法 二、化学合成法 三、基因文库法 四、PCR扩增法 作为基因载体应具备的条件： (1)本身是一个复制子，能自我复制； (2)相对分子质量要小，小分子DNA易处理，限制性内切酶切点少，适于接受目的基因(外源基因)； (3)能给寄主细胞(受体细胞)提供可选择标记、可供辨认的表形特征，以便人们进行筛选。 (4)只有单一限制性内切酶切点，经某一限制性内切酶切割后，既可以把质粒DNA闭环打开以接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。 第五节 基因重组 将目的基因和载体DNA在体外连接构建形成重组子。 黏性末端连接法：直接粘接法 加尾粘接法 平头连接法 第五节 转化、增殖和表达 一、转化 1.受体细胞：指在转化、转导中接受外源基因的细胞。 受体细胞应具备的性能： 具有接受外源DNA能力； 应为限制性内切酶缺陷型菌株或者为DNA重组型菌株； 在标记上和载体相对应； 有利于表达，如选择核糖体对mRNA识别专一性较低的突变株； 不适于在人体内或在非培养条件下生存，有利于安全。 常用受体细胞： 细菌：大肠杆菌、枯草杆菌 放线菌：链霉菌 酵母菌 2.感受态：感受态是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。 转化效率影响因素： 对数生长期的细胞转化能力最强； 氯化钙处理和电处理能提高转化效率； 原生质体转化。 3.扩增检筛 用含抗生素的培养基进行初筛，然后通过原位杂交、电泳等方法筛出带有目的基因的转化子。 二、基因表达 基因表达：通过DNA重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，并使特定基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质(或酶)，甚至进而获得它们的代谢产物，这一过程称为基因表达。 第七节 基因工程在食品工业中应用 一、利用基因工程改造食品微生物 二、转基因动物食品 三、转基因微生物食品 一、利用基因工程改造食品微生物 应用： 提高食品产品品质。 简化工艺，缩短生产周期。 食品的抗菌和防腐保鲜。 食品级酶制剂的生产菌的改良。 生产保健食品有效成分。 食品微生物快速