遗传学实验四质粒DNA的提取与鉴定.doc

实验四 质粒DNA的提取与鉴定 一、实验目的 1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。 2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。 二、实验原理 质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。 从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。 在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA分开。CccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。电泳后用溴化乙锭染色，在紫外照射下观察和照相记录电泳图谱。 三、材料、仪器和试剂 材料 大肠杆菌菌种 仪器 超净工作台或无菌室，恒温摇床，低温高速离心机，移液器，恒温水浴锅，涡旋振荡器，电泳仪，制冰机，凝胶成像系统等。 试剂 （1）LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，NaCl 10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.5，用去离子水定容至1升，高压灭菌20min。 （2）LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。?? （3） 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100mL，高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。 （4）溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L NaOH母液稀释），1％SDS。? （5）溶液Ⅲ：5mol/L KAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，定容至100mL，并高压灭菌。溶液终浓度为：[K+] 3mol/L，[Ac-] 5mol/L。? （6）饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 （7）氯仿：按氯仿:异戊醇＝24:1的体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。? （8）TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 ? （9）电泳所用试剂：① TBE缓冲液（5×）：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA（pH8.0）20mL，定溶至1000mL。② 上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。 四、操作步骤 1、大肠杆菌的培养和质粒的扩增 2、质粒DNA的提取 （1） 取1-5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(~13,400×g ) 离心1 分钟，尽量吸除上清（若菌