肠道微生物体外模型研究进展.docVIP

肠道微生物体外模型研究进随着分子微生态学，特别是高通量测序技术的发展，人 类对肠道微生物的作用有了新的突破性认识。我们现在了解 到人体和动物消化道系统中生长着大量的细菌，肠道中细菌 的总数量甚至高出人体细胞总数的十倍。肠道微生物的菌群 多样性受到多种因素的影响。其中环境和宿主的遗传背景在 决定肠道菌群结构和组成方面各自起到 50% 的作用。而且 由于外部环境在肠道菌群结构形成过程中的巨大影响，个体 之间肠道菌群结构和组成极为不同。目前的研究证明只有极 少数的细菌存在于大多数人的肠道中。而个人之间菌群结构的不同反过来又直接影响到宿主的免疫系统发育和营养物质 的吸收，甚至和自身免疫性疾病的产生相关。肠道微生物现 在认为是人体的一个新“器官”。而肠道微生物生态的研究 近十年来也受到了广泛的重视。但是肠道微生物研究存在的 重要的瓶颈在于样品的采集。对正常人来说，除了收集粪便 之外，小肠、升结肠、横结肠等部位的取样几乎不现实。另一 方面，由于肠道细菌受到外部环境和宿主肠道环境的双重影 响，如何区分外部环境和肠道内环境对肠道菌群的作用变得 十分重要。所以，建立合理而易操作的体外模型对推动肠道 微生态学、人体和动物营养学的发展非常有意义。本文就国内外目前经常使用的用于肠道微生态研究的体外肠道模型做 一简单介绍。体外肠道模型的发展 1 静止发酵或罐批量培养模型 此模型为最原始、最简单 的体外发酵模型。该发酵在小瓶子中或者 pH 控制的批量发 酵罐中进行。具体做法为在批量发酵罐中接入动物肠内容物 或人粪便菌群的悬浮液，培养基中含有不同的待测碳水化合 物或蛋白质，整个发酵过程在充满氮气或二氧化碳的下进行。 该模型简单、易操作，可以同时对多种底物进行比较，所以用于对碳水化合物的初步筛选。缺点是只能用于短期的发酵 研究，因为培养物内 pH 和营养物水平变化很快群的改变 导致该模型对肠道环境的模拟效果不理想 。而 且，由于死亡的细菌不能及时从发酵系统中清理出去，如果采 用分子生态学的检测手段，如荧光定量 PCR 或 FISH 等方法 无法区别死亡细菌还是活细菌，所以该模型不适用于使用 16S rRNA 的分子生态学实验手段来测定菌群的变化，使用范 围有比较大的局限性。但常规微生态学手段，如采用选择性培养基培养活细菌的方法还是能够测定菌群变化的。由于 24 h 之后培养基中养分已被大量消耗，而发酵终产物不断累 积，长时间培养结果离肠道实际内环境偏差很大。GIBSON 和 FULLER 报道用此模型进行研究在 48 h 内结果还是比较稳定 可靠2 连续发酵培养系统 食糜在人体和大部分单胃动物消 化系统中按照口到肛门的单方向流动，所以肠道细菌在单胃动物肠道中的发酵可以看做是一种恒温连续发酵的过程。发 酵工艺中连续发酵的特点和肠道发酵特点比较接近，所以通过恒化连续发酵工艺从理论上可以模拟肠道细菌发酵的自然 过程。COATES 等首先设计了连续发酵培养系统，在这个系统中可以连续的加入新鲜培养基同时移除使用过的废液。随 着设计工艺和制造技术的不断发展，研究人员已经可以在体外控制这个连续培养系统的 pH、温度、氧化还原能和营养状 态等，来控制发酵罐中细菌的数量与菌群结。最原始的连续培养是单相连续发酵模型。但由于大肠环境的复杂性 及不同肠道位置的解剖结构和环境存在差异，单相连续发酵 模型的局限性越来越明显，继而 GIBSON 和 MACFARLAN 等根据人体结肠的生理特点建立了三相连续发酵模型，同时通过比较该群的结构特点和突然死亡的人体肠道菌群的生理生化指标之间的相关性，对该模型的可靠性进行了验证。研究结果表明三相连续发酵模型能较好的模拟各个肠 道解剖位置，即升结肠、横结肠和降结肠环境中肠道菌群的实际结构。现在常用的三相连续发酵系统由三个发酵瓶 V1、V2 和 V3 串联而组成，它们各自的容积分别为 0． 22、0． 32 和 0． 32 升，分别代表升结肠、横结肠和降结肠的生理位置。根据人体 肠道不同解剖位置的实际生理特点，三个罐的 pH 分别控制 在 5． 5、6． 2 和 6． 8，整体温度控制在 37 。每个发酵瓶都用 磁力搅拌器以一定速度进行搅拌以混匀培养基，同时充入无 氧氮气，以维持发酵瓶的厌氧环境。如图 1 所示，培养基从培养瓶依次流入 V1，再从 V1 流入 V2，V2 流入 V3，最后从 V3 流入废液罐中。其营养物质的流向和人体结肠中营养物质的流同。连续培养模型目前广泛应用在肠道细菌的生理、生化研究1． 3 人类肠道微生态模拟器 由于三相连续发酵模型仅仅 模拟了人体结肠部位的肠道微生物小肠的微生物。1993 年 MOLLY 等 设计了一个五相反应器，命名为人类肠道微生态模拟器。该模拟系统被认为能够 全方位，更好的的模拟人体肠道内的微环境。如图